我们详细描述了利用电穿孔技术将质粒DNA高效转染至活体小鼠足部肌肉纤维，以及随后通过荧光显微镜观察蛋白表达的实验步骤。
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本文内容
摘要
摘要
对细胞生物学日益增长的兴趣之一是表达经过转基因修饰的关键蛋白质形式（例如，荧光标记的构建体和/或突变体变体），以研究其内源性分布及功能相关性。为在完全分化的细胞中实现这一目标，已实施的一种有趣方法是in vivo 通过各种方法将质粒转染到特定组织（如肝脏）中1，骨骼肌2,3，甚至大脑4. 本文详细介绍了一套高效将遗传物质转染至肌肉纤维的必要操作步骤趾短屈肌（FDB）和interosseus (IO) 成年小鼠的眼外肌，使用一种in vivo 电穿孔方法。实验参数已经过优化，以最大限度地增加转染的肌纤维数量，同时尽量减少可能影响单根肌纤维中表达蛋白质量和数量的组织损伤。我们已验证，采用本文所述方法可获得高水平的可溶性蛋白，例如 EGFP 和 ECFP。3，钙蛋白酶（calpain）、FKBP12、β2a-二氢吡啶受体（β2a-DHPR）等；结构蛋白，即微型抗肌萎缩蛋白（minidystrophin）和α-辅肌动蛋白（α-actinin）；以及膜蛋白，即α1s-二氢吡啶受体（α1s-DHPR）、雷诺丁受体1（RyR1）、心肌Na/Ca2+交换器、NaV1.4 钠通道、SERCA1 等，在应用于小鼠和大鼠的 FDB、IO 及其他肌肉时。其中部分蛋白质的高效表达已通过生物化学方法验证3以及功能性证据5然而，迄今为止我们最常用的验证方法是标准荧光显微镜和双光子激光扫描显微镜（TPLSM），这些方法不仅能够鉴定荧光标记蛋白构建体的整体表达情况，还能确定其详细的细胞内定位。该方法同样可用于转染编码具有生理学意义蛋白的质粒（如本文所示），或用于转染旨在抑制正常表达蛋白的干扰RNA（siRNA）（此应用尚未被我们测试）。值得注意的是，对FDB和IO肌纤维进行转染对于哺乳动物肌肉生理学研究具有特别重要的意义，因为从这些肌肉经酶解分离得到的肌纤维目前是研究兴奋性及兴奋-收缩耦合基本机制最为合适的模型之一，可在电流钳或电压钳条件下进行相关研究。2,6-8.
方案
实验步骤 体内 FDB和IO肌肉的电穿孔
- 开始之前 体内 电穿孔实验方案中，哺乳动物表达质粒必须扩增，使其浓度达到每微升TE缓冲液含2-5 μg质粒。 注意：我们常规使用商业扩增试剂盒，并遵循制造商提供的操作步骤。携带CMV启动子的商业表达质粒在骨骼肌体内转染中效果良好。
- 吸取所需体积（10–20 μl）的质粒溶液，分装至两个0.5 ml离心管中（每管用于小鼠的一只足）。
- 在无菌Tyrode液中配制含有2 mg/ml透明质酸酶的溶液。
- 使用麻醉箱，通过经批准的气体麻醉机以4%异氟烷（O2为载体）对小鼠进行深度麻醉。将动物置于加热垫（37 °C）上，并通过啮齿类动物面罩维持麻醉状态。通过脚趾夹捏反射监测麻醉深度。
- 在解剖显微镜下观察，使用一支1英寸长、33号规格的无菌针头，将10 μL透明质酸酶溶液注入小鼠一只脚的足垫皮下。从靠近足跟处刺入皮肤，将针头沿皮下向前推进至脚趾基部约1/4英寸处。
- 如有需要，可对另一只脚重复该操作。
- 断开麻醉装置，将小鼠放入笼中，使其完全从麻醉状态恢复。
- 一小时后，再次麻醉动物并将其置于加热垫上。参照透明质酸酶溶液的操作步骤，注射总共20–50 μg质粒DNA（根据质粒构建体的大小而定），每足总注射体积应小于20 μL。 注意：当15-20 μ必要时，建议使用组织胶封闭皮肤穿刺点.
- 断开麻醉装置，将小鼠放入笼中。让其从麻醉中完全恢复，并等待10-15分钟。
- 第三次麻醉动物，并将其置于加热垫上。
- 选择动物的一只足。在足跟处皮下插入一根镀金针灸针，另一根针插入足趾基部皮下。两根电极相互平行，并垂直于足部的长轴方向。
- 使用微型夹连接器将针头（电极）连接到电刺激器上。通过施加20次脉冲进行电穿孔，每次持续20毫秒，频率为1赫兹。根据电极间距，通过示波器监测调整脉冲电压幅度，以产生约100伏/厘米的电场。 注意：如果麻醉程度充分，则不应观察到对刺激的任何收缩反应。
- 如有需要，可在动物的对侧足部重复上述操作步骤。
- 将动物放回笼中，在其完全从麻醉中恢复后继续进行观察。注意：如果操作过程正常，动物应在30分钟内恢复完全活动能力，之后即可送回动物房。足垫注射透明质酸酶和DNA对动物未见明显不良影响。 麻醉恢复后，小鼠可在笼内正常行走。作为额外预防措施，可在动物饮水中添加卡洛芬（Carprofen）作为镇痛剂，浓度为0.0027 mg/ml，持续2天。
- 蛋白表达可在转染后2至8天进行检测。然而，许多蛋白的持续表达已可观察到持续数月之久。
注：所有动物实验程序均已通过加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会（UCLA Chancellor's Animal Research Committee）批准，符合《动物福利法》和《公共卫生服务关于实验动物人道使用政策》的要求。
代表性结果：
正确实施 体内 上述电穿孔操作应能有效实现质粒在FDB和IO肌肉中的转染。然而，转基因蛋白变体的表达效率将取决于质粒本身、蛋白的大小与复杂性、蛋白的功能特性，以及其他诸多不可控因素。如图1所示，FDB肌肉在存在商用质粒的情况下进行电穿孔pmR-mCherry编码 mCherry 蛋白，根据大多数肌纤维呈现红色荧光这一事实可知，我们的转染方案成功转染了大部分肌纤维。但这并不排除个别纤维中蛋白表达水平存在差异，或少数纤维完全未被转染的可能性3。需要注意的是，大量表达荧光蛋白（如 mCherry，EGFP、ECFP 和 EYFP 不会影响肌纤维的兴奋性及兴奋-收缩耦合特性。事实上，其特性与假转染肌肉中的表现无异（结果未显示）。
用于验证荧光标记蛋白在骨骼肌纤维中局部表达的实用方法。
细胞内定位 从头合成 表达的转基因蛋白通常通过双光子激光扫描显微镜（TPLSM）同时获取相应标签的荧光图像以及细胞结构的明确标记物图像来进行常规评估。后者最常见的标记物包括：a) 由肌节A带（位于M线中心）肌球蛋白各向异性产生的二次谐波生成（SHG）图像9,10；以及 b) 使用膜不通透性电位敏感染料di-8-ANEPPS对肌纤维表面膜及横管（T管）系统膜进行标记后获得的di-8-ANEPPS荧光图像11。在用di-8-ANEPPS染色的肌纤维荧光图像中，T管表现为大致垂直于肌纤维长轴的狭窄荧光带。这些荧光带之间的间距不均：它们之间跨越M线的距离较长，而跨越Z线的距离较短。11.
骨骼肌纤维中α-肌动蛋白结合蛋白-EGFP的表达与定位。
图2展示了结构肌蛋白α-肌动蛋白结合蛋白（α-actinin）的一种带标签变体表达示例。该蛋白是Z线的主要组成成分之一，因此常被用作标记该结构的指标12。我们将质粒转染至FDB肌和IO肌中 pEGFPN1-α-肌动蛋白交联蛋白1 编码人（非肌）α-肌动蛋白素（α-actinin），其C末端标记有EGFP。转染后第六天，通过EGFP荧光分布评估发现，α-肌动蛋白素主要表达于沿肌纤维轴向等距分布的狭窄条带中。每个肌节可见一条带（图2A） & 2D）。通过比较EGFP荧光分布与SHG（图2B）及di-8-ANEPPS（图2E）图像，可证明这些条带与Z线的共定位。如叠加图像所示（图2C），α-肌动蛋白结合蛋白-EGFP条带与SHG条带交替排列，表明其位于两个连续M线之间的中点，与Z线的位置一致。在转染并用di-8-ANEPPS染色的肌纤维中，α-肌动蛋白结合蛋白-EGFP条带位于每对T小管的中央（图2F），而T小管已知分布在Z线两侧（即间距较短），因此表明转基因表达的α-肌动蛋白结合蛋白定位于Z线。
表达N端带有EGFP标签的DHPRα1s
通过TPLSM图像（例如图3A）验证了pEGFPC1.1-DHPR α1s 对肌肉的转染效率，结果显示大多数肌纤维表达了EGFP-DHPRα1s（一种跨膜蛋白）。转染肌纤维最显著的特征是EGFP荧光呈现双带状模式（图3A和3B），这与该蛋白靶向定位至横小管（T-tubules）的预期一致。从图3还可观察到，尽管不同肌纤维的荧光强度各异，但单根肌纤维的带状荧光模式沿其长度方向保持均一。在更高放大倍数下（图3B），可清晰看到各荧光带之间的间距不均，这与使用di-8-ANEPPS染色的肌纤维中观察到的模式相似（例如图2E）。叠加图像（图3B和3E）表明，SHG信号带位于EGFP-DHPRα1s荧光带之间较大的间隔区域，进一步证实该蛋白定位于横小管。此外，利用非荧光疏水性阴离子DPA⁻进行的FRET测量（数据未显示）进一步证明，EGFP基团距离横小管膜内层仅数纳米。
EYFP-ClC1 表达的定位与功能评估
转染了编码骨骼肌氯离子通道（ClC1）N端EYFP标签融合蛋白的pEYFP-ClC1质粒的肌纤维，显示出EYFP荧光条带（图4A），其分布模式与EGFP-DHPRα1s表达所观察到的模式相似（图3A），并与di-8-ANEPPS染色所示的T小管排列相对应（图2E）。正如预期，EYFP-ClC1（图4A）与SHG图像（图4B）叠加后的结果（图4C）表明，SHG条带位于EYFP荧光条带之间的较大间距中央。
为了评估EYFP-ClC1的表达是否如功能性氯离子通道过表达所预期的那样，显著增加肌纤维的静息电导，我们通过酶解法分离了转染FDB肌肉的肌纤维，并采用先前描述的双微电极实验装置6,11,13研究其电生理特性。图5展示了两个肌纤维的实验结果：其中一个肌纤维表达大量EYFP-ClC1（通过标准荧光显微镜下的整体荧光强度测量确定，结果未显示），另一个为未转染的对照组。图5A中的电压记录（来自表达EYFP-ClC1的肌纤维）表明，由于静息电导过高，该纤维几乎无法兴奋。需要使用高达400nA（0.5ms）的电流刺激脉冲才能引发非常微弱的动作反应（无超射，图5A）。当将外部Tyrode溶液替换为含有500 μM氯离子通道阻断剂9-ACA的溶液后，仅需200 nA的电流脉冲即可引发动作电位（图5B），尽管其速度明显慢于且波形宽于对照组肌纤维中记录到的动作电位（图5C）。与预期一致，加入9-ACA对这一对照组肌纤维影响极小（图5D）。
图 1. 体内电穿孔法的转染效率。 使用 pmR-mCherry 转染的 FDB 肌肉的明场（A）和荧光（B）图像。电穿孔操作后天数：12 天。请点击此处查看图 1 的放大版本。
图2. α-肌动蛋白结合蛋白-EGFP在FDB肌纤维中的表达与定位。 图A和图B分别为表达α-肌动蛋白结合蛋白-EGFP的肌纤维的EGFP荧光图像和二次谐波生成（SHG）图像。图C为图A与图B图像的叠加。图D和图E分别为另一根表达α-肌动蛋白结合蛋白-EGFP的肌纤维的荧光图像及其经di-8-ANEPPS染色后的图像。图F为图D与图E图像的叠加。电穿孔处理后天数：6天。
图 3. FDB 肌纤维中 EGFP-DHPRα1s 的表达与靶向定位。图 A 为表达 EGFP-DHPRα1s 的一组肌纤维的 EGFP 荧光图像。图 B 为图 A 中方框区域的放大图像，以更清晰地显示蛋白表达的条带状模式。图 C 为与图 A 对应的 SHG 图像。图 D 为图 A 与图 C 图像的叠加结果。图 E 为图 D 中所示区域的进一步放大图像。电穿孔处理后天数：20 天。
图 4. FDB 肌纤维中 EYFP-ClC1 的表达与定位。图 A 和图 B 分别为表达 EYFP-ClC1 的肌纤维的 EYFP 荧光图像和 SHG 图像。图 C 为图 A 和图 B 图像的叠加。图 D 为沿图 C 中白色标示线测得的强度分布曲线。电穿孔实验后天数：7 天。
图5. 表达转基因EYFP-ClC1的肌纤维的电生理学评估。 图A和图B分别为表达EYFP-ClC1的肌纤维在9-ACA处理前和处理后对电流脉冲响应的电压记录。图C和图D分别为未转染肌纤维在9-ACA处理前和处理后对电流脉冲响应所诱发的电压记录（动作电位）。
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讨论
我们在此描述了为实现将DNA质粒有效转染至骨骼肌纤维所需遵循的详细步骤 体内 电穿孔。本方法的主要优势在于操作简便，且侵入性极小，因而对动物几乎不构成健康风险。实际上，上述电穿孔方案仅涉及每只足部进行两次皮下注射，随后实施电刺激程序，整个过程在麻醉条件下对动物具有良好的耐受性。在我们机构，这些操作被整体认定为非手术性操作，因其不涉及皮肤切开。此外，电穿孔操作的温和性是实现高效质粒转染及肌纤维后续蛋白表达的关键因素，因为任何显著的细胞损伤都会削弱其高效进行活性蛋白合成的能力。
对本文所述方案进行微调后，可（且已被）应用于小鼠足部较大的肌肉（例如 趾长伸肌，EDL； 胫骨前肌，TA；以及比目鱼肌）。此外，仅通过按比例增加总DNA量，我们已成功将此处所述的完全相同的操作流程应用于成年大鼠的FDB和IO肌肉的转染。
尽管转染方案在肌肉纤维中表达转基因蛋白的水平始终存在差异，但这种变异性可在生理学实验中加以利用：非表达纤维可作为对照，而表达水平不同的纤维则可用于分析表达水平与功能变化...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢加州大学洛杉矶分校神经生物学系的 T. Otis 博士与我们共享双光子激光扫描显微镜（TPLSM）设备，感谢德国亚琛工业大学生理学研究所的 C. Fahlke 博士慷慨赠送 pEYFP-ClC1 质粒，以及感谢 R. Serrano 先生提供的技术支持。本研究得到了美国国立卫生研究院/国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH/NIAMS）资助项目 AR047664 和 AR54816 的资助。
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