本方案描述了在不使用动物血清的情况下，分离并随后扩增间充质基质细胞和内皮集落形成细胞，以生成用于实验性移植的自体配对细胞。
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本文内容
摘要
摘要
脐带是具有高增殖潜能的前体细胞的丰富来源，包括间充质基质细胞（也称为间充质干细胞，MSCs）和内皮集落形成前体细胞（ECFCs）。这两种细胞类型在维持组织完整性方面起着关键作用，并且可能也参与再生过程和肿瘤形成。
为了以比较的方式研究它们的生物学特性与功能，从同一供体获取这两种类型的细胞至关重要。此外，为了再生医学的目的，从同一组织中分离间充质干细胞（MSCs）和内皮集落形成细胞（ECFCs）也可能具有优势。
由于细胞治疗最终需要从实验室走向临床，我们建立了一种新方法，用于在不使用动物蛋白的情况下分离并进一步扩增前体细胞。在整个实验方案的所有步骤中，均以混合人血小板裂解液（pHPL）替代胎牛血清，从而完全避免细胞与异源蛋白的接触。
本视频展示了一种从一根脐带中分离和扩增前体细胞的方法。
将描述所有材料和方法。
方案
第1部分：准备工作
1. 细胞培养基的制备
开始培养基制备前，请收集所需的所有材料和工具。
解冻两份56 ml的混合人血小板裂解物（pHPL，自制：参考文献1及JoVE #1523）、10 ml的100倍青霉素/链霉素溶液，以及两份各5 ml的L-谷氨酰胺（均来自Sigma）。
将细胞因子和生长因子分装液（VEGF、bFGF、EGF、IGF、氢化可的松、抗坏血酸、肝素、两性霉素，作为“单次份”提供）解冻，用于补充1瓶（500 mL）EGM-2培养基（Lonza）。
从冰箱中取出以下两种培养基各一瓶（500 ml）：(i) α-修改型最低必需培养基（a-MEM）和 (ii) 内皮细胞基础培养基（EBM）。
以下所有步骤均须在层流组织培养罩内的无菌条件下进行。
通过将无防腐剂的肝素粉末（例如 Biochrom）溶于无菌水，配制成终浓度为 1000 IU/mL 的溶液。
MSC培养基：
取500 mL的a-MEM，加入56 mL解冻后的pHPL（详见参考文献1）和不含防腐剂的肝素（2 IU/mL，即224 μL原液），使pHPL的终浓度为10%（肝素可防止血浆中纤维蛋白原聚集导致培养基凝固）。此外，加入青霉素（100 U/mL）/链霉素（100 μg/mL）溶液和2 mM L-谷氨酰胺（均来自Sigma）。
使用20 μm孔径的真空滤膜（Millipore）过滤培养基。妥善标记瓶子（内容物、日期）。
ECFC培养基：
取一瓶（500 mL）EBM 培养基，向基础培养基中加入细胞因子分装液、56 mL pHPL、不含防腐剂的肝素（10 IU/mL，即 1120 μL 原液）、青霉素（100 U/mL）/链霉素（100 μg/mL）溶液以及 2 mM L-谷氨酰胺，使用孔径为 20 μm 的真空滤器（Millipore）过滤。妥善标记瓶身（注明内容物和日期）。
2. 手术器械的灭菌
镊子、锋利的手术剪和手术刀柄必须经过热力灭菌，或使用无菌一次性用品。
3. 准备脐带采集管
向50 ml聚丙烯管（Falcon）中加入500 IU无防腐剂肝素，并用PBS调节至20 mL终体积。将这些管子转移至分娩室。
4. 知情同意（需经您所在机构的伦理委员会或机构审查委员会确认）。
在分娩前询问父母是否愿意捐赠一段脐带，并充分告知他们脐带将用于哪些用途。
5. 脐带捐献
分娩后，在检查胎盘和脐带时，截取一段10 cm长的脐带，并立即放入预先加入肝素的试管中，以防止脐带血管内残留血液发生凝固。应尽快继续进行细胞分离操作。
第二部分：细胞分离
- 使用Incidin或70%乙醇清洁超净工作台表面。将无菌的150 cm2细胞培养皿、75 cm细胞培养瓶（均为Corning品牌）、PBS、灭菌外科器械、细胞刮刀、试管架、25 mL移液管以及配备钝端针头的5 ml注射器妥善放置于已清洁的超净工作台内。
- 将预先配制的α-MEM和EGM-2细胞培养基在水浴中预热至37°C。
- 从产房取得脐带后，将其转移至配备细胞培养超净台的实验室。将脐带转移至超净台后，用PBS冲洗两次（每次转移至新的培养皿），以去除污染的血细胞。在一侧插入配备钝端针头的无菌5 mL注射器，对脐静脉进行灌洗，用PBS冲洗直至另一端流出的液体完全透明（若呈红色则提示存在血液污染）。
内皮集落形成细胞（ECFCs）：
- 准备一个 75 cm2 的培养瓶（Corning），标记后加入 15–20 mL 预热的 EGM-2 培养基。
- 将脐带放入盛有无菌 PBS 的新培养皿中。
使用手术剪将脐带剪成两段，每段长约 5 cm（较短的片段更易于处理，因为脐带血管沿其轴向呈螺旋状扭曲）。 - 尝试找到脐静脉（较大的血管），插入手术剪的一侧刀片，沿纵向切开静脉。此时若有助手用两把镊子夹住已切开的静脉，可帮助你继续剪切，操作会更加方便。
- 将切开静脉的脐带段放入不含 PBS 的新培养皿中，取细胞刮刀，从一端到另一端反复刮擦脐静脉的内表面（内皮表面）。通过在培养基中冲洗刮刀尖端，将刮下的细胞转移至已准备好的培养瓶中。此操作至少重复 10 次。
- 盖紧培养瓶，放入培养箱中（37°C，5% CO2，95% 湿度）。
间充质干细胞：
- 准备一个 150 cm2 培养皿（Corning）并做好标记。
- 取已刮除内皮层的脐带组织，使用无菌剪刀和无菌手术刀将整段脐带切成非常小的组织块，每块最大尺寸应为 1–2 mm。
- 用无菌镊子将脐带组织块转移至预先标记好的培养皿中。在加入培养基前将培养皿敞口放置 5 分钟，有助于组织块更好地贴附于塑料表面。
- 待脐带组织块适当贴附于培养皿表面后，轻柔加入 30–35 mL 预热的 α 改良最低必需培养基（alpha modified MEM）。操作时尽量以最低速度加入，以确保所有组织块保持贴附状态。
- 盖好培养皿，放入培养箱中（37°C，5% CO2，95% 湿度）。
第3部分：细胞扩增及通过流式细胞术确认免疫表型
细胞扩增
外泌体样囊泡（EFCFs）：
- 次日使用倒置显微镜检查内皮细胞的贴壁情况，并更换全部EGM-2培养基，以去除所有未贴壁的细胞和颗粒。
- 将细胞扩增至融合状态，并每周两次更换三分之一的培养基。当细胞达到融合时，使用0.05%胰蛋白酶/0.7 mM EDTA消化细胞，并将其转移至新的培养容器中。根据T75培养瓶中细胞的数量，选择合适规格和数量的新培养瓶，以确保后续扩增时具有较低的接种密度。
- 在细胞扩增期间，每周两次更换三分之一的培养基。
间充质干细胞：
- 间充质干细胞从脐带组织块向外生长所需时间较长，因此可等待至少3-4天后，在倒置显微镜下观察贴壁组织块周围是否出现纺锤形细胞。当细胞向外生长充分时，组织块会因与塑料培养表面失去接触而趋于脱落。
- 培养10-12天后，移除组织块，使用0.05%胰蛋白酶/0.7 mM EDTA将间充质干细胞从培养皿表面消化下来，并转移至新的培养容器中。根据原培养皿中细胞的数量，选择合适规格和数量的新培养瓶，以确保后续扩增时维持较低的接种密度。
- 在细胞扩增期间，每周更换两次培养基，每次更换三分之一。
流式细胞术
所需设备：
流式细胞仪（BD FACSCalibur），微量离心管（Corning），试管架，羊血清（封闭试剂），Eppendorf 离心机（Eppendorf），单克隆抗体
间充质干细胞（MSCs）：CD45、CD14、CD19、HLA-DR、CD31、CD73、CD90、CD105、同型对照
内皮集落形成细胞（ECFCs）：CD45、CD14、CD19、HLA-DR、CD31、CD34、CD90、CD105、CD144、CD146、同型对照
- 细胞达到汇合状态后，使用 0.05% 胰蛋白酶/0.7 mM EDTA 消化细胞，并在 4°C 下以 300g 离心 7 分钟。
- 将细胞重悬于修饰的 PBS 中，调整细胞浓度至 1×106 个细胞/mL，在 4°C 下用 10% (v/v) 羊血清封闭非特异性抗体结合位点，孵育 20 分钟。
- 标记微量管，并向各管中加入适当浓度的荧光标记抗体。
- 向每管中加入 50 μL 已封闭的细胞悬液，在 4°C 下孵育 30 分钟。
- 通过加入修饰的 PBS 洗涤细胞，去除未结合的抗体。
- 将标记好的细胞送至流式细胞仪，进行分析。
第4部分：内皮集落形成细胞（ECFC）集落生长、固定、染色及层级分析
- 将几乎纯化的收获的内皮集落形成细胞（ECFCs）以极低的接种密度（每平方厘米3或10个细胞）接种于细胞培养板中，以促进单个克隆的生长。
- 每周两次更换三分之一的培养基。
- 培养14天后（培养结束），吸除培养基，用PBS洗涤两次，并在冰箱中用预冷的固定液（丙酮 : 甲醇 = 3 : 2）固定克隆15分钟。
- 弃去固定液，将培养板敞口放置10分钟使其干燥。
- 用蒸馏水重水化细胞10分钟。
- 加入Harris苏木精溶液，对固定的克隆染色12分钟。
- 移除苏木精溶液，并用自来水冲洗培养板，以去除残留的染色液。
- 使用体视显微镜拍摄每个克隆的照片，并将*.jpg或*.tif格式的文件导入计算机。
- 使用ImageJ软件打开照片，并按照动画中的说明分析每个克隆的准确细胞数量。
- 打开ImageJ软件，通过下拉菜单中的“文件\打开”功能导入克隆图像。
- 接着使用“处理\减去背景”功能。
- 在ImageJ菜单中使用“*椭圆*或画笔选择”工具标记克隆边缘。
- 使用“编辑\清除外部”功能清除周围图像，并通过选择“图像\裁剪”来裁剪图片。
- 手动调整阈值，使用“图像\调整\阈值”功能，使所有细胞完全显示为红色。
- 通过选择“分析\分析颗粒”来计数克隆中的细胞数量。选择合适的设置（针对每种细胞类型优化），然后点击“确定”。结果窗口将显示细胞计数，同时生成一张包含已计数细胞对应轮廓的新图像。
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讨论
获取间充质干细胞（MSCs）或内皮集落形成细胞（ECFCs）的来源多种多样，包括骨髓、脂肪组织、脐带血等。
必须从同一来源获取这两种前体细胞，以直接比较不同类型细胞在组织和血管再生过程或对肿瘤进展的贡献中的作用。
从同一供体中分离并随后研究自体配对的内皮集落形成细胞（ECFCs）和间充质干细胞（MSCs）的简便性，使得该方法在排除个体实验中供体差异方面具有优势。
通过传代步骤将造血细胞可能的污染降至最低，并通过流式细胞术加以确认。
若操作正确，分离得到的细胞应具备以下特征：（i）具有祖细胞的特性，（ii）可获得足够数量用于实验性移植，以及（iii）经流式细胞术确认为高纯度。
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披露
作者声明无任何经济利益冲突。
致谢
作者感谢Katharina Schallmoser提供pHPL，Eva Rohde和Nicole Hofmann对稿件提出的有益意见，Daniela Thaler和Margaretha Frühwirth提供的技术协助，Monica Farrell的语言编辑，以及Uwe Lang、Margit Holzapfel和Sandra Eppich在妇产科部门提供的脐带样本。
本工作得到了奥地利科学基金会（FWF，项目号 N211-NAN，授予 DS）、奥地利研究促进署（FFG，项目号 N200，授予 DS）以及成人干细胞研究基金会（A.R.）的支持。A.R. 是格拉茨医科大学分子医学博士培养项目的研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 改良α-MEM培养基 | Sigma-Aldrich | ||
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | ||
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich | ||
| EBM培养基 | Lonza Inc. | ||
| 单种细胞因子添加剂 | Lonza Inc. | ||
| 75 cm2 培养瓶 | Corning | ||
| 150 cm2 培养板 | Corning | ||
| 细胞刮刀 | Corning | ||
| 胰蛋白酶/EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| 单克隆抗体 | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| 50 ml 离心管 | Falcon BD | ||
| 500 mL 滤器，20 μm 孔径 | EMD Millipore | ||
| 不含防腐剂的肝素 | Biochrom AG |
参考文献
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Strunk, D. Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy. Transfusion. 45, 315-326 (2005).
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