本方案描述了在不使用动物血清的情况下，分离并随后扩增间充质基质细胞和内皮集落形成细胞，以生成用于实验性移植的自体配对细胞。
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本文内容
摘要
摘要
脐带是具有高增殖潜能的前体细胞的丰富来源，包括间充质基质细胞（也称为间充质干细胞，MSCs）和内皮集落形成前体细胞（ECFCs）。这两种细胞类型在维持组织完整性方面起着关键作用，并且可能也参与再生过程和肿瘤形成。
为了以比较的方式研究它们的生物学特性与功能，从同一供体获取这两种类型的细胞至关重要。此外，为了再生医学的目的，从同一组织中分离间充质干细胞（MSCs）和内皮集落形成细胞（ECFCs）也可能具有优势。
由于细胞治疗最终需要从实验室走向临床，我们建立了一种新方法，用于在不使用动物蛋白的情况下分离并进一步扩增前体细胞。在整个实验方案的所有步骤中，均以混合人血小板裂解液（pHPL）替代胎牛血清，从而完全避免细胞与异源蛋白的接触。
本视频展示了一种从一根脐带中分离和扩增前体细胞的方法。
将描述所有材料和方法。
方案
第1部分：准备工作
1. 细胞培养基的制备
开始培养基制备前，请收集所需的所有材料和工具。
解冻两份56 ml的混合人血小板裂解物（pHPL，自制：参考文献1及JoVE #1523）、10 ml的100倍青霉素/链霉素溶液，以及两份各5 ml的L-谷氨酰胺（均来自Sigma）。
将细胞因子和生长因子分装液（VEGF、bFGF、EGF、IGF、氢化可的松、抗坏血酸、肝素、两性霉素，作为“单次份”提供）解冻，用于补充1瓶（500 mL）EGM-2培养基（Lonza）。
从冰箱中取出以下两种培养基各一瓶（500 ml）：(i) α-修改型最低必需培养基（a-MEM）和 (ii) 内皮细胞基础培养基（EBM）。
以下所有步骤均须在层流组织培养罩内的无菌条件下进行。
通过将无防腐剂的肝素粉末（例如 Biochrom）溶于无菌水，配制成终浓度为 1000 IU/mL 的溶液。
MSC培养基：
取500 mL的a-MEM，加入56 mL解冻后的pHPL（详见参考文献1）....
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讨论
获取间充质干细胞（MSCs）或内皮集落形成细胞（ECFCs）的来源多种多样，包括骨髓、脂肪组织、脐带血等。
必须从同一来源获取这两种前体细胞，以直接比较不同类型细胞在组织和血管再生过程或对肿瘤进展的贡献中的作用。
从同一供体中分离并随后研究自体配对的内皮集落形成细胞（ECFCs）和间充质干细胞（MSCs）的简便性，使得该方法在排除个体实验中供体差异方面具有优势。
通过传代步骤将造血细胞可能的污染降至最低，并通过流式细胞术加以确认。
若操作正确，分离得到的细胞应具备以下特征：（i）具有祖细胞的特性，（ii）可获得足够数量用于实验性移植，以及（iii）经流式细胞术确认为高纯度。
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披露
作者声明无任何经济利益冲突。
致谢
作者感谢Katharina Schallmoser提供pHPL，Eva Rohde和Nicole Hofmann对稿件提出的有益意见，Daniela Thaler和Margaretha Frühwirth提供的技术协助，Monica Farrell的语言编辑，以及Uwe Lang、Margit Holzapfel和Sandra Eppich在妇产科部门提供的脐带样本。
本工作得到了奥地利科学基金会（FWF，项目号 N211-NAN，授予 DS）、奥地利研究促进署（FFG，项目号 N200，授予 DS）以及成人干细胞研究基金会（A.R.）的支持。A.R. 是格拉茨医科大学分子医学博士培养项目的研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 改良α-MEM培养基 | Sigma-Aldrich | ||
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | ||
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich | ||
| EBM培养基 | Lonza Inc. | ||
| 单种细胞因子添加剂 | Lonza Inc. | ||
| 75 cm2 培养瓶 | Corning | ||
| 150 cm2 培养板 | Corning | ||
| 细胞刮刀 | Corning | ||
| 胰蛋白酶/EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| 单克隆抗体 | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| 50 ml 离心管 | Falcon BD | ||
| 500 mL 滤器，20 μm 孔径 | EMD Millipore | ||
| 不含防腐剂的肝素 | Biochrom AG |
参考文献
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Hu....
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重印与许可
