本方案展示了一种简单的单分子荧光显微镜技术，用于实时观察单个复制体进行的DNA复制过程。
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摘要
摘要
我们介绍一种基于荧光显微镜的简单实时方法，用于在单分子水平上观察DNA复制。将环状分叉的DNA模板固定在功能化玻璃盖玻片上，加入复制蛋白和核苷酸后，DNA可被大量复制（图1）。通过层流拉伸正在生长的双链DNA（dsDNA）产物，并利用嵌入染料进行可视化。实时测量DNA延伸末端的位置，可精确确定复制速率（图2）。此外，完成复制的DNA产物长度可反映复制的持续性。该实验操作简便、快速，仅需配备灵敏度适中的相机的荧光显微镜即可完成。
关键词：荧光显微镜，单分子检测，DNA复制，复制速率，复制持续性，双链DNA（dsDNA）
方案
在进行单分子复制实验之前，需要预先准备一些材料。
1. DNA复制模板
复制反应的底物是采用标准分子生物学技术制备的带有生物素标记且具有尾部的M13滚环1,2。
材料：M13mp18 单链 DNA，生物素标记的尾部寡核苷酸引物（5'-Biotin-T36AATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCT-3'），T7 DNA 聚合酶，加热块，苯酚/异戊醇/氯仿
- 在TBS缓冲液中，将生物素标记的尾部寡核苷酸与M13退火（尾部寡核苷酸终浓度为330 nM，M13终浓度为33 nM，寡核苷酸过量10倍）。
- 将混合物置于加热块中于65 °C加热。加热完成后关闭加热块，使其缓慢冷却，以确保引物正确退火。
- 将已退火的M13加入含有dNTPs和MgCl2的T7 DNA聚合酶（终浓度64 nM）与T7复制缓冲液的混合物中。
- 在37 °C孵育反应12分钟，随后用100 mM EDTA终止反应。
- 通过苯酚/氯仿/异戊醇抽提纯化填补完成的产物DNA，并透析至TE缓冲液或其他合适的储存缓冲液中，测定DNA浓度（每次有机相抽提后均需进行反向提取，以回收残留的已退火M13）。
- 一次模板制备可轻松获得数毫升纳摩尔浓度的模板，足以支持数百至数千次单分子实验。
2. 功能化盖玻片
为了将DNA固定在玻璃盖玻片上，首先用氨基硅烷对玻璃进行功能化处理，然后将其与生物素化的PEG分子偶联。这种涂层有助于减少DNA和复制蛋白与表面的非特异性相互作用1,3。
材料： 玻璃盖玻片、染色缸、3-氨丙基三乙氧基硅烷、甲氧基-PEG5k-NHS酯、生物素-PEG5k-NHS酯、丙酮、1M KOH、乙醇、烘箱、水浴超声仪
- 将玻璃盖玻片放入染色缸中，并用乙醇充满染色缸，彻底清洗盖玻片。超声处理30分钟，倒出乙醇，用1 M KOH溶液冲洗染色缸并充满，再次超声处理30分钟。上述清洗步骤各重复一次。
- 进行第一次功能化反应前，必须去除所有残留水分。用丙酮充满染色缸，超声处理10分钟，再用丙酮冲洗染色缸一次。
- 在丙酮中配制体积分数为2%的硅烷试剂溶液。将该溶液加入染色缸中，振荡反应2分钟。此反应使氨基硅烷的烷氧基与玻璃表面偶联，留下可用于下一步偶联反应的活性氨基。用大量水淬灭反应。
- 将盖玻片置于110 °C烘箱中烘烤30分钟，使其干燥。
- 在100 mM NaHCO3（pH 8.2）溶液中配制甲氧基与生物素化PEG比例为50:1的混合液，目标生物素化PEG浓度约为0.2 % w/v。
- 用移液器吸取100 μL PEG混合液滴加到干燥的硅烷化盖玻片上，再将另一片盖玻片覆盖其上。加入玻璃盖玻片作为间隔物，可使两片盖玻片保持分离状态。
- 将盖玻片在PEG溶液中孵育3小时，随后分开每对盖玻片，并用大量水充分洗涤。操作时需小心保持盖玻片的功能化面朝上，因为仅有一侧被PEG包被。
- 将盖玻片干燥后置于真空环境中保存。表面功能化效果至少可稳定保持一个月，因此可一次性批量制备数十片盖玻片，按需使用。
这些材料应提前制备，然后在每次实验中使用。每次单分子实验开始时，首先组装流动池。
3. 流动腔室的制备
实验使用一个简单的流动池进行，该流动池由经过功能化的盖玻片、双面胶带、石英载片和管路构成。每次单分子实验需准备一个流动池1,4。
材料：双面胶带、剃刀刀片、带管孔的石英载玻片、快干环氧树脂、功能化盖玻片（见上文）、链霉亲和素溶液（25 μL，1 mg/mL，溶于PBS中）、管路、封闭缓冲液（20 mM Tris pH 7.5，2 mM EDTA，50 mM NaCl，0.2 mg/mL BSA，0.005% Tween-20）
- 首先将 20–25 mL 封闭缓冲液放入真空干燥器中，以去除后续步骤中可能存在的气泡。
- 取一片 PEG 功能化的盖玻片，并在其表面铺加 125 µL 用 PBS 稀释的链霉亲和素溶液。在准备流动池其他组件的同时，让其孵育 20 分钟，使链霉亲和素与表面的生物素结合。
- 裁剪一块双面胶带，使其尺寸与石英载玻片匹配。用铅笔在胶带上标记出管路孔的位置，以便在胶带上画出流动室的轮廓（1 mg/mL）。
- 在孔周围制作一个宽 2 mm 的矩形区域。该区域将作为流动通道，因此需确保边缘平直，并在进样口和出样口周围留出足够空间。如有需要，可使用多个通道或不同尺寸的通道。
- 沿所画轮廓进行切割，确保切口平直、干净，避免胶粘剂突入通道内。
- 使用丙酮或乙醇彻底清洗石英载玻片，以去除之前构建流动池时残留的胶粘剂。
- 找到通道轮廓的最佳对齐位置，撕去胶带一侧的背衬保护膜，小心地将胶带贴附到石英载玻片上。注意对齐位置，确保进样口和出样口不被堵塞。
- 裁剪适当长度的管路，用于流动池的进样口和出样口。将管路末端以约 30° 角斜切，有助于防止管路末端紧贴流动池底部。将管路放置在适当的支撑物上，使其悬空，便于下一步连接到流动池。
- 用去离子水彻底冲洗已包被链霉亲和素的盖玻片，并用压缩空气吹干。请注意，仅一侧经过功能化处理，切勿将盖玻片翻转。撕去胶带另一侧的背衬保护膜，将石英载玻片贴合到盖玻片上。
- 轻轻按压盖玻片，以排出粘合剂中可能夹带的空气。这有助于防止气泡进入流动通道。
- 用环氧树脂密封流动室的四周。将已裁剪的管路插入石英片的孔中，并用环氧树脂固定。此步骤需静置数分钟使其干燥。
- 待环氧树脂完全干燥后，开始进行表面封闭：通过其中一根管路抽吸部分脱气的封闭缓冲液。21 号针头可完美插入 0.76 mm 的管路中。反复冲洗数次以彻底去除气泡，并让流动室至少孵育半小时。
4. 单分子复制实验
材料：制备好的流动腔、SYTOX Orange、全内反射荧光显微镜（TIRF显微镜）、532 nm激光器、CCD相机、配备图像采集软件的计算机、滚环DNA底物、复制蛋白
- 封闭流通池后，即可开始单分子实验。
- 取流通池并将其放置在显微镜载物台上。用载物台夹固定腔室，并确保流道沿 y 轴方向平直对齐。
- 使用较大直径的连接管或针头将流通池出口管连接至注射泵。将入口置于封闭缓冲液中，并回拉注射器以去除管路中的空气。轻轻弹击出口管有助于清除滞留在流通池内的气泡。
- 用 1 mL 封闭缓冲液将储备 DNA 模板稀释至 25 pM。以中等流速注入腔室，以实现良好的 DNA 表面覆盖率。0.025 mL/min 流动 30 分钟效果良好。可根据每批盖玻片表面的 DNA 分子数量或实验所需分子数进行调整。
- DNA 注入后，使用封闭缓冲液洗去多余的 DNA。至少清洗 200 个流通池体积，以彻底去除所有游离 DNA。
- 开始对复制缓冲液进行脱气处理。对于 E. coli 复制实验，应在 37 °C 下进行，以减少加热流通池时产生气泡的风险。
- 打开激光器和相机。冷却 CCD 需要达到工作温度后方可使用。
- 若进行 37 °C 实验，请开启加热器。确保物镜与流通池接触，否则后续会成为热沉影响温度控制。
- 完成清洗和脱气后，可准备反应体系。在复制缓冲液中混合核苷酸、DTT 和 SYTOX。然后加入蛋白质并轻柔混匀。
- 将反应混合物注入流通池。此流速需足以拉伸双链 DNA。对于宽度为 2 mm、高度为 100 μm 的流道，0.04 mL/min 的流速效果良好。
- 给予足够时间使混合物进入腔室，然后开始成像。建议将视野移至流道侧边，并对准粘合材料进行聚焦，以确保聚焦位置接近表面。
- 调节激光功率、显微镜焦距和 TIRF 角度。保持较低功率以避免染色 DNA 发生光切割。根据 DNA 复制速率，以 1–5 帧/秒采集数分钟图像。如需更长的复制轨迹，可重复采集，或移动至新视野以观察更多分子。
- 当反应混合物即将耗尽时，建议注入含 SYTOX 的缓冲液以观察其他视野。对不同复制分子进行多次成像可为持续性分析提供统计学数据。
5. 代表性结果
活跃复制的分子可清晰地显示为染色的DNA延伸条带。在我们的实验中，以25 pM的M13底物流动时，在60倍镜下可观察到100至1000个分子。 125 μm x 125 μm 视野（图1）。使用以下方法进行重复实验 E. coli 复制体蛋白在 37 °C （详见材料部分）每个视野可产生5-50个复制分子。在T7复制体浓度相当的情况下，由于其在底物上启动效率更高，我们观察到 >70% 的分子在视野中发生复制。这些条件产生的产物密度极高，导致单个分子难以分辨和分析，因此T7实验在较低的蛋白质浓度下进行。
数据分析：为了获得反应速率数据，只需将DNA的终点长度对时间作图，并计算其斜率（图2）。对于持续合成能力的分析，需确定DNA的总长度。这两个数值均需转换为碱基对（base pairs）。在开展实验之前，应明确在适当放大倍数下相机的像素尺寸。在进行碱基对换算时，可依据DNA的晶体学长度（2.9 bp/nm）进行合理估算。然而，层流无法将DNA完全拉伸，因此建议通过已知长度的DNA（例如48,502 bp的λ DNA）进行DNA长度校准：使用生物素化寡核苷酸将其固定在流动池中，并在复制实验所用的流速下测量其经SYTOX染色后的长度。由此可确定每像素对应的碱基对数目，从而准确计算复制速率和持续合成能力。采集大量图像和视频可获得足够数量的产物分子，进而绘制出复制速率和持续合成能力的分布图（图2）1。
图1： （参考文献1） a) 滚环复制检测示意图。（SA，链霉亲和素）。前导链合成延伸连接环状模板与表面的尾部。该尾部由后随链聚合酶转化为双链DNA，并在层流作用下被拉伸。
b) 使用SYTOX Orange染色并在532 nm激发下的视野示例。微小的荧光点为被固定的非复制底物。注意产物的极长形态以及每个视野中大量的产物数量（每条流动池包含 >5000 个这样的视野）。
图 2：（改编自参考文献 1）a,b) 来自 T7 (a) 和 E. coli (b) 实验的典型复制分子的明场图像。c) 将 a) 和 b) 中分子的终点轨迹对时间作图。通过线性回归拟合轨迹以获得复制速率。图示示例分别为 99.4 bp s-1 和 467.1 bp s-1。d) 复制产物的长度分布，通过单指数衰减拟合以获得持续合成能力：25.3 ± 1.7 kbp（T7），85.3 ± 6.1 kbp（E. coli）。e) 单分子轨迹的速率分布，通过单高斯函数拟合。平均值为：75.9 ± 4.8 bp s-1（T7），535.5 ± 39 bp s-1（E. coli）。
讨论
一个关键的对照是检测染料SYTOX Orange对目标复制蛋白的影响。实现这一点的简单方法是按照前述方法在流动池中进行复制实验，但省略SYTOX。当反应混合物流经反应室后，加入含SYTOX的缓冲液以染色DNA，并分析复制分子的长度分布。或者，也可使用常规的体相反应来检测SYTOX对复制速率和效率的任何影响。
本实验仅使用一个流体通道。通过构建多通道流动室或使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）等微流控装置，可轻松实现多通道。增加通道数量可显著提高蛋白质浓度、突变体或抑制分子的筛选效率，并加快数据重复采集的速度。
如前所述，我们使用自制的铝制流动池加热器、电阻加热元件（筒式加热器）和可调电源，在 37 °C 下进行 E. coli 复制实验。这种方法具有良好的温度稳定性，并避免了购买物镜加热器的需要。为了校准加热器，我们只需在石英流动池顶部的中央钻一个孔，将热电偶插入流动通道，并像平常一样流过缓冲液。通过在逐渐升高的电压下测量流动池中缓冲液的温度，可实现精确的加热控制。
致谢
Samir Hamdan 协助开发了此技术。E. coli 蛋白来自伍伦贡大学 Nick Dixon 教授的实验室，T7 蛋白来自哈佛医学院 Charles Richardson 教授的实验室。本工作由美国国立卫生研究院（GM077248，资助 A.M.v.O.）和 Jane Coffin Childs 基金会（J.J.L.）提供资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| M13mp18 单链DNA | 新英格兰生物实验室 | N4040 | |
| 生物素化尾部寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | ||
| T7 DNA聚合酶 | New England Biolabs | M0274 | 使用 T7 复制缓冲液进行底物制备 |
| 苯酚/异戊醇/氯仿 | 罗氏集团 | 03117987001 | 24:24:1 体积比 |
| 3-氨基丙基-三乙氧基硅烷 | Sigma-Aldrich | A3648 | 其他氨基硅烷可单独使用或与非氨基反应性硅烷混合，以获得更稀疏的表面 |
| 丙烯酸琥珀酰亚胺酯 PEG | Nektar | 类似的 PEG 可从 Nanocs、CreativePEGWorks 等公司购买。 | |
| 生物素-PEG-NHS | Nektar | ||
| 双面胶带 | Grace Bio-Lab 公司 | SA-S-1L | 100 μm 厚度 |
| 石英载玻片 | 技术玻璃 | 20 毫米（宽）× 50 毫米（长）× 1 毫米（高） | 裁剪至适合盖玻片大小。使用金刚石钻头（DiamondBurs.net）钻孔 |
| 聚乙烯管 | BD Biosciences | 427416 | 0.76 mm 内径，1.22 外径 可使用其他尺寸的管子替代。 |
| 链霉亲和素 | Sigma-Aldrich | S4762 | 配制 1 mg/mL 溶液，25 μPBS pH 7.3 中的 L 等分试样 |
| 脱氧核糖核苷三磷酸溶液混合物 | 新英格兰生物实验室 | N0447 | |
| 核糖核苷三磷酸溶液 | Amersham | 272056 272066 272076 272086 | |
| SYTOX Orange | Invitrogen | S11368 | 其他双链DNA染料也可使用 |
| 配备60倍TIRF物镜的荧光显微镜 | 奥林巴斯公司 | IX-71 | 显微镜、相机等设备可用类似仪器替代 |
| 注射泵 | 哈佛仪器 | 11 Plus | 以换液模式运行，以方便更换溶液 |
| 532 nm 激光器 | 相干公司 | Compass 215M-75 | 选择与所选染料对应的波长 |
| EMCCD 相机 | 滨松光子株式会社 | ImagEM | |
| 发射滤光片 | Chroma Technology Corp. | HQ600/75m | |
T7 复制：40 mM Tris pH 7.5，50 mM 谷氨酸钾，10 mM 氯化镁，100 μg/mL BSA，含 5 mM 二硫苏糖醇，600 μM dNTPs，300 μmM ATP, 300 μM CTP，以及使用前立即加入的15 nM SYTOX Orange。蛋白质添加如下：5 nM gp4（六聚体）、40 nM 聚合酶（1:1 gp5:硫氧还蛋白）、360 nm gp2.51,5. 大肠杆菌 复制： 50 mM HEPES pH 7.9，12 mM 醋酸镁，80 mM 氯化钾，100 μg/mL BSA，含 10 mM 二硫苏糖醇（DTT）、40 μM dNTPs，200 μM rNTPs，以及使用前立即加入的15 nM SYTOX Orange。蛋白质添加量如下：30 nM DnaB（六聚体）、180 nM DnaC（单体）、30 nM αεθ，15 nM τ2γ1δδ’χψ 或 τ3δδ’χψ，30 nM β （二聚体），300 nM DnaG，250 nM SSB（四聚体），20 nM PriA，40 nM PriB，320 nM PriC，480 nM DnaT1,6 | |||
大肠杆菌 复制： 50 mM HEPES pH 7.9，12 mM 醋酸镁，80 mM 氯化钾，100 μg/mL BSA，含 10 mM 二硫苏糖醇（dithiothreitol）、40 μM dNTPs，200 μM rNTPs，以及在使用前立即加入的15 nM SYTOX Orange。蛋白质添加量为：30 nM DnaB（六聚体）、180 nM DnaC（单体）、30 nM αεθ，15 nM τ2γ1δδ’χψ 或 τ3δδ’χψ，30 nM β （二聚体），300 nM DnaG，250 nM SSB（四聚体），20 nM PriA，40 nM PriB，320 nM PriC，480 nM DnaT1,6 |
参考文献
- Tanner, N. A., et al. Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication. Nucleic Acids Res. 37, e27(2009).
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