我们展示了利用慢病毒介导递送人源因子Oct4、Sox2、Nanog和Lin28，将人体体细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方案。通过细胞形态及胚胎干细胞（ES）特异性标志物的表达，证实了细胞的多能性。
本文内容
摘要
摘要
2006年，山中伸弥及其同事首次证明，通过逆转录病毒介导的方式递送并表达 Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4，能够诱导小鼠成纤维细胞进入多能状态。1 该研究团队还报道，使用逆转录病毒载体递送相同转录因子的人源版本，可成功将人类体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPS细胞）。2 此外，James Thomson 等 报道，通过慢病毒介导共表达另一组因子（Oct4、Sox2、Nanog 和 Lin28），也能够将人类体细胞重编程为 iPS 细胞。3
诱导多能干细胞（iPS细胞）在形态、增殖能力以及分化为体内所有组织类型的能力方面与胚胎干细胞（ES细胞）相似。与胚胎干细胞相比，人类iPS细胞具有显著优势，因其在不涉及胚胎破坏所引发的伦理问题的前提下，展现了胚胎干细胞的关键特性。患者特异性iPS细胞的生成克服了个性化再生医学治疗中的一个重要障碍，避免了移植非自体细胞可能引发的免疫排斥反应。
本文展示了使用 Stemgent 人源转录因子慢病毒套装对人成纤维细胞进行重编程的实验方案。我们还显示，使用该套装重编程的细胞在转导后第4天即开始呈现诱导性多能干细胞（iPS）的形态特征。通过使用 Stemolecule Y27632，我们在经过三轮连续的克隆挑选和传代后，成功筛选出具有正确形态的iPS细胞。此外，我们证实重编程后的细胞表达多能性标志物碱性磷酸酶（AP），表面标志物 TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA-4 和 SSEA-3，以及核内标志物 Oct4、Sox2 和 Nanog。
方案
1. 重编程
- 以每孔 1 × 105 个细胞的密度将 BJ 细胞接种于 6 孔板中。在 37°C、5% CO2 条件下，用 2 ml 生长培养基（450 ml EMEM 加 50 ml 经 ES 认证的 FBS、5 ml 10 mM 非必需氨基酸、5 ml 青霉素/链霉素、5 ml 200 mM L-谷氨酰胺和 0.9 ml 55 mM β-巯基乙醇）培养细胞过夜。
- 同日，开始制备 MEF 饲养层板：将 0.1% 的明胶水溶液加入 6 孔板中，37°C、5% CO2 条件下孵育过夜。
- 孵育后，吸除 BJ 细胞的培养基，每孔加入 2 ml 含 6 μg/ml 多聚素（polybrene）、500 μl hOct4-慢病毒、50 μl hSox2-慢病毒、50 μl hNanog-慢病毒和 50 μl hLin28-慢病毒的生长培养基。轻轻摇动培养板以确保培养基均匀覆盖。37°C、5% CO2 条件下孵育过夜。
- 同日，从液氮中取出一管 CF-1 MEF 细胞并解冻。吸除明胶包被孔中的液体（见步骤 1.2），按每孔 0.2 × 105 个细胞的密度加入 MEF 饲养层细胞。每孔总体积应为 2 ml MEF 生长培养基（450 ml DMEM 加 50 ml FBS 和 5 ml 非必需氨基酸）。
- 次日，用 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 消化 BJ 细胞，200 × g 离心 5 分钟。吸除上清，用生长培养基重悬细胞。吸除 MEF 饲养层板中的培养基（见步骤 1.4），每孔加入 2 ml BJ 细胞悬液，细胞浓度约为 5 × 104 个细胞/孔。37°C、5% CO2 条件下孵育过夜。
- 重新接种 24 小时后，更换为人类胚胎干细胞/诱导多能干细胞培养基（400 ml DMEM/F12 加 100 ml Knockout 血清替代物、5 ml 10 mM 非必需氨基酸、5 ml 200 mM L-谷氨酰胺、0.9 ml 55 mM β-巯基乙醇和 20 ng/ml 人重组 bFGF）。此后每 24 小时换液一次，持续 7 天。
- 七天后，将培养基更换为 MEF 条件培养基（见第 2 部分）。
2. 小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基的制备
- 以每孔 2 x 105 个细胞的密度，将 CF-1 MEF 饲养层细胞接种于 6 孔板中，每孔加入 2 ml MEF 生长培养基。在 37°C、5% CO2 条件下孵育过夜。
- 更换为人胚胎干细胞/诱导多能干细胞培养基。在 37°C、5% CO2 条件下继续孵育过夜。
- 连续四天，每 24 小时收集一次上清液，并通过 0.22 μm 滤膜过滤。
- 在上清液中添加 50 ng/ml 的 bFGF。
3. iPS 克隆筛选与传代
- 选择一个类似胚胎干细胞（ES）的克隆，并将其重新接种于已接种CF-1 MEF饲养层细胞的培养皿中，培养基为添加了10 μM Stemolecule Y27632的人胚胎干细胞/诱导多能干细胞（ES/iPS）培养基。在37°C、5% CO2条件下孵育过夜。
- 前七天内每24小时更换一次培养基（不添加Stemolecule Y27632）。七天后，更换为MEF条件培养基（制备方法见第2节）。持续传代培养细胞，直至其呈现典型的人胚胎干细胞形态。
4. 多能性标志物的免疫细胞化学检测
- 用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。
- 加入 500 μl 固定液，在室温下固定细胞 20 分钟。
- 用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。
- 加入 500 μl 封闭缓冲液，在室温下封闭非特异性结合位点 1 小时。
- 加入 250 μl 特异性一抗，在 4°C 条件下孵育过夜（我们使用 TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA-4、SSEA-3、Oct4、Sox2、Nanog 和 Lin28，稀释比例为 1:100）。
- 用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。
- 加入 250 μl 二抗，在室温下避光孵育 1 小时（我们使用 Goat anti-Mouse IgM Cy3 conjugate、Goat anti-Mouse IgG Cy3 conjugate、Goat anti-Rat IgM Cy3 conjugate 和 Goat anti-Rabbit Cy3 conjugate，稀释比例为 1:300）。
- 用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。
- 在最后一次洗涤液中加入 DAPI（终浓度为 1 μg/ml），孵育 5 分钟以显示细胞核。
- 在显微镜下观察细胞。
第5部分：代表性结果
1. 形态学结果：
人包皮成纤维细胞（BJ细胞）被共同转导了Oct4、Sox2、Nanog和Lin28。转导后第4天即可观察到形态学变化，第17天时细胞簇变得更加紧密（图1）。在第25天手动挑选克隆，并在CF-1 MEF饲养层细胞上进行培养。为了促进重编程后诱导性多能干细胞（iPS细胞）克隆的形成，每次传代时初始过夜接种均使用Stemolecule Y27632（一种ROCK抑制剂）。经过连续三轮的克隆挑选和传代后，观察到具有良好形态的iPS细胞克隆。
2. 多能性标志物的表达：
为了进一步表征分离的诱导多能干细胞（iPS细胞）克隆，我们检测了这些细胞中是否存在在胚胎干细胞（ES细胞）中常见表达的多能性标志物。这些克隆显示出强烈的碱性磷酸酶（AP）活性（图2）。此外，我们对iPS细胞克隆进行免疫细胞化学（ICC）分析，使用一组针对多能性标志物的特异性抗体，包括表面标志物TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA-4和SSEA-3，以及核内标志物Oct4、Sox2和Nanog。分离的iPS细胞克隆对所有检测标志物均呈阳性（图3）。ICC结果表明，这些iPS细胞表现出典型的多能性标志物表达模式，证明其与未分化的人胚胎干细胞高度相似。
图1： 转导后BJ细胞的形态学变化。转导后（A）4天和（B）17天形成的典型iPS细胞克隆的明场图像。
图 2： 重编程的 BJ 细胞的碱性磷酸酶（AP）活性。使用 Stemgent 碱性磷酸酶染色试剂盒对三个不同的集落进行染色。
图3：人诱导多能干细胞高表达以下胚胎干细胞特异性标志物：表面标志物 TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA-4 和 SSEA-3，以及核内标志物 Oct4、Nanog 和 Sox2。
讨论
这些结果表明，Stemgent 人转录因子慢病毒套装可通过在人成纤维细胞中诱导转导的转录因子异位表达，高效生成诱导多能干细胞（iPS）克隆。在设计重编程实验时，应考虑多个变量以优化重编程效率。首先，在初次转导步骤中，可能需要调整活性病毒与靶细胞的比例（感染复数，M.O.I.），以达到最佳的转导效率。其次，靶细胞的生长状态会影响重编程效果，健康且具有增殖能力的细胞更易于进行重编程。第三，在针对不同细胞数量修改实验方案时，建议根据培养皿的表面积按比例调整靶细胞数量。最后，可考虑使用ROCK抑制剂（如Y27632），因为近期研究已证明其有助于提高人胚胎干细胞（hES）克隆的存活率，从而确保重编程成功。4,5
披露
本文作者受雇于Stemgent公司，该公司生产本文所使用的试剂和仪器。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人TF慢病毒套装 | Stemgent | 00-0005 | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| TRA-1-81 抗体 | Stemgent | 09-0012 | |
| TRA-1-60 抗体 | Stemgent | 09-0009 | |
| SSEA-4 抗体 | Stemgent | 09-0003 | |
| SSEA-3 抗体 | Stemgent | 09-0014 |
参考文献
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thompson, J. A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (1917).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Koyanagi, M., Takahashi, J., Arakawa, Y., Doi, D., Fukuda, H., Hayashi, H., Narumiya, S., Hashimoto, N. Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors. J. Neurosci. Res. 86, 270-280 (2008).
重印与许可
