人类胚胎干细胞的冻存与复苏

摘要

自从 James Thomson 等人在 1998 年开发出分离和培养人胚胎干细胞（hES）的技术以来，将细胞冷冻以备后续使用，以及从冻存细胞中复苏并扩增细胞，已成为常规 hES 细胞培养中的重要操作步骤。由于 hES 细胞对冻融过程中的应激极为敏感，必须格外小心。本文演示了从液氮中快速复苏 hES 细胞、将其接种在小鼠胚胎饲养层细胞上的正确技术，以及用于长期保存的缓慢冷冻方法。

摘要

自从詹姆斯·汤姆森等1998年开发了一种在培养中分离和培养人胚胎干细胞（hES）的技术，此后，将细胞冷冻以备后续使用，以及从冻存细胞库中解冻并扩增细胞，已成为常规hES细胞培养中的重要操作步骤。由于hES细胞对冻融过程中的应激极为敏感，必须格外小心。本文演示了从液氮冻存库中快速解冻hES细胞、将其接种至小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，以及为长期保存而进行慢速冷冻的正确操作技术。

方案

1. 解冻人胚胎干细胞

实验前准备

1. 在解冻人胚胎干细胞（hES细胞）前一天，将经照射处理的CF1品系小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作为饲养层接种于经明胶包被的6孔组织培养板的一个孔中，使用MEF培养基（DMEM基础培养基添加10%热灭活胎牛血清和1%非必需氨基酸）。于37°C、5% CO₂条件下培养过夜。
2. 在从液氮中取出hES细胞之前，务必准备好所有必需的设备和试剂，确保解冻过程高效且成功。

解冻人胚胎干细胞

3. 使用金属镊子从液氮储存罐中取出一管人胚胎干细胞（hES细胞）冻存管。
4. 将冻存管在戴着手套的双手之间滚动3-5秒，以去除表面霜冻。
5. 记录冻存管标签上的信息。
6. 用金属镊子将冻存管浸入37°C水浴中。轻轻摇晃冻存管，并频繁（但迅速！）将其举至光源前观察解冻进程，以判断冰晶大小。切勿将冻存管的管盖浸入水浴中，以免造成细胞污染。
7. 当仅剩少量冰晶时，将整个冻存管浸入乙醇中进行表面消毒。
8. 在无菌生物安全柜内，将冻存管中的内容物直接转移至15 mL锥形离心管底部。
9. 缓慢向离心管中加入4 mL hES细胞培养基（DMEM/F-12基础培养基，添加20% Knockout血清替代物、1% 非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺、0.2% β-巯基乙醇和4 ng/mL bFGF）。在加入新培养基的同时，轻轻摇动离心管，使细胞持续均匀混合。
10. 以200 × g离心5分钟。

hES 细胞接种

11. 当hES细胞处于离心过程中时，准备MEF饲养层培养板，并标注相应的hES细胞信息：细胞系、传代次数和解冻日期。
12. 当离心剩余时间约为2分钟时，吸除MEF培养基，并向孔中加入1.0 mL PBS。
13. 将离心后的hES细胞移回生物安全柜，小心吸除上清液。注意不要吸走细胞沉淀，但应尽可能去除上清液，因为该溶液中含有冷冻保存液中的DMSO。
14. 使用5 mL玻璃移液管加入2.5 mL hES细胞培养基，轻轻吹打3–4次，使细胞沉淀非常轻柔地重悬。
15. 吸除MEF饲养层孔中的PBS，然后缓慢将全部2.5 mL hES细胞悬液加入6孔板中已准备好的孔内。
16. 将培养板放入37°C培养箱中，轻轻地前后、左右滑动培养板，使细胞在孔内均匀分布。切勿以环形方式旋转培养板，以免细胞集落集中在孔中央。
17. 在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜，使细胞贴壁。
18. 解冻后的第二天，移除培养基（包括任何漂浮的细胞），并向孔中加入2.5 mL新鲜的hES细胞培养基。
19. 可选步骤：可将移除的培养基和细胞转移至另一块预先准备好的MEF饲养层培养板中。此步骤通常可形成新的细胞集落，可与原始解冻样品中的细胞平行培养。
20. 将培养板在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。

2. 冻存hES细胞

1. 当 hES 细胞在离心机中离心时，在生物安全柜内标记好冻存管，包括细胞系名称、传代次数和冻存日期。hES 细胞冻存的典型密度为每支冻存管冻存一个六孔板中的单孔细胞。
2. hES 细胞离心结束后，将离心管移回生物安全柜。小心吸除上清液，注意不要扰动松散的细胞沉淀。
3. 用适量的 hES 细胞培养基重悬细胞沉淀：每支冻存管加入 0.5 mL hES 细胞培养基。吹打时务必轻柔，因为 hES 细胞以相对较大的集落片段形式冻存时复苏效果更佳。
4. 在轻轻摇动离心管的同时，缓慢加入适量（每支冻存管 0.5 mL）的 2X hES 细胞冻存液（60% 定义型胎牛血清、20% hES 细胞培养基和 20% DMSO）。加入冻存液后，极其轻柔地吹打混合 1 至 2 次。
5. 迅速而轻柔地将 1 mL 细胞悬液加入每支冻存管中。
6. 将冻存管放入异丙醇冻存盒中，并置于 -80°C 冰箱中过夜。在异丙醇冻存盒中，细胞将以每分钟 1°C 的速率缓慢降温冻存。
7. 次日，使用金属镊子迅速将冻存管转移至液氮储存罐中。

代表性结果

人类胚胎干细胞解冻后的第一天，小克隆可能呈透明状，在显微镜下不易观察。由于新解冻的胚胎干细胞增殖较慢，可能需要数天才可形成明显的克隆（图1）。

图1. 细胞回收与生长。 从液氮中解冻的hES细胞被拍摄了图像  解冻后第1、7和11天

讨论

随附视频演示了一种人胚胎干细胞（hES细胞）的冻存与复苏方法。冻存在液氮中的细胞应进行复苏 尽快进行灌流 以获得最佳复苏效果。解冻细胞时务必格外小心：尽量减少对细胞的操作，并轻柔吹打。一管人胚胎干细胞（hES细胞）可接种至一个6孔板的单孔，或接种至4孔板的全部孔中，并立即放入培养箱。由于在四个独立孔中培养可降低整个培养物因污染而丢失的风险，且在较小的表面积上更易于定位hES细胞克隆，因此首次解冻hES细胞时，建议使用4孔板。

解冻 hES 细胞后的第一天，细胞集落较小，可能呈透明状。应每天更换 hES 细胞培养基，即使在显微镜下尚未观察到明显的集落，因为 hES 细胞可能需要数天的培养时间才能形成稳定的集落。解冻细胞时必须使用新铺的 MEF 饲养层，因为集落通常需要在解冻后 10 至 12 天才能达到适合传代的大小。

解冻时 低代次 人胚胎干细胞（hES细胞）冻存管在使用时，建议扩增并额外冻存多管细胞，以保留低代次细胞库存，用于后续培养和实验。同时，常规将所有“多余”的健康hES细胞进行冻存，以维持充足的冷冻储备，也是一种良好实践。最成功的解冻及后续培养案例，通常来源于高质量、未分化、处于活跃分裂状态的hES细胞克隆，并以较大细胞团块形式轻柔操作，有助于提高冻存后复苏效率。最终细胞团块的大小应与常规传代时接种的团块大小相似或略大。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
D-MEM	Invitrogen	11965-092	用于MEF培养基
胎牛血清（FBS），已认证	Invitrogen	16000-044	热灭活 用于MEF培养基
D-MEM/F-12	Invitrogen	11330-057
无血清替代物（Knockout Serum Replacement）	Invitrogen	10828-028	预先筛选以确保支持hES细胞生长
bFGF	Stemgent	03-0002	终浓度为[4 ng/mL]
非必需氨基酸	Invitrogen	11140-050
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-081	200 mM（100倍浓缩液） 终浓度为[1倍]
PBS	Invitrogen	14190-250	不含Ca2+和Mg2+
IV型胶原酶	Invitrogen	17104-019	用D-MEM/F-12配制1 mg/mL的新鲜溶液
明胶	Sigma-Aldrich	G1890	A型，猪源
DMSO	Sigma-Aldrich	D2560	用于冻存培养基
定义型胎牛血清（FBS）	Hyclone	SH300.70.01	用于冻存培养基
6孔板	Nalge Nunc international	140675	用于常规培养
4孔板	Nalge Nunc international	176740	用于解冻细胞
5 mL玻璃移液管	Fisher Scientific	13-678-27E	独立包装
15 mL锥形管	Corning	430052	聚丙烯材质
冻存管	Nalge Nunc international	5000-1020	容量1.5 mL
程序降温盒	Nalge Nunc international	5100-0001	Mr. Frosty”