无孔径近场红外显微镜的组装、调谐与应用：用于蛋白质成像

摘要

本文描述了用于成像蛋白质聚集体的近场红外显微镜的组装方法。

摘要

本文旨在指导读者完成一种用于突破衍射极限成像的红外近场显微镜的组装与操作。该无孔径近场显微镜是一种基于光散射原理的仪器，可实现约20 nm空间分辨率的红外光谱成像。文中提供了完整的组件清单及分步操作流程。讨论了组装与仪器调谐过程中常见的错误。展示了一组代表性数据，呈现了淀粉样纤维的二级结构。

方案

背景：

无孔径探针近场红外显微技术可实现高空间分辨率成像。这是一种相对较新的技术，其原理是：一束入射红外光被一个在悬臂共振频率下振荡的尖锐原子力显微镜（AFM）探针尖端散射，该探针靠近样品表面。红外探测器收集散射光，并在该共振频率或其谐波频率下进行解调。通过这种方式，可以显著降低聚焦激光束照射样品其他区域所产生的背景散射，从而实现远超光衍射极限的空间分辨率，获得具有纳米级空间分辨能力的红外对比图像^i,ii,iii。由于AFM探针尖端的尺寸远小于激光束的聚焦区域，所产生的散射光信号非常微弱。为了增强这一散射场，通常采用外差检测技术，即在收集到的散射场中加入一个参考场，并调节两者的相对相位，使探测器处产生最大程度的相长干涉。此时，散射强度与参考电场的幅值成正比^{iv, v, vi}。在近场成像中，一个重要的问题是避免由AFM探针z方向运动所引起的伪影^{vii, viii, ix, x, xi}。如Mueller et al. 此前所示，通过适当调节外差相位并排除显著的形貌特征，可减轻这一问题。该技术已可靠地用于获取材料的实验散射光谱，空间分辨率优于30 nm₁₅。近场显微技术在生物材料上的应用也已有先例，特别是针对烟草花叶病毒^xii和大肠杆菌（E. Coli）^xiii等大分子的研究。

在本报告中，我们展示了此类成像装置的组装过程。同时，我们利用无孔径近场扫描红外显微镜（ANSIM）获得了由β₂-微球蛋白的#21-31肽段形成的淀粉样纤维的二级结构信息。近场图像与形貌图同步采集，从而能够检测并获取单根纤维的散射光谱。

我们的无孔径近场扫描红外显微镜（ANSIM）测量系统为自制装置。实验装置的示意图如图1所示。采用原子力显微镜（AFM，Multimode，Veeco Instruments，美国圣塔芭芭拉）用于测量样品表面形貌，并产生在探针振荡频率处调制的近场增强散射信号。使用轻敲模式的NSC14/Ti-Pt铂涂层悬臂梁（MicroMasch，爱沙尼亚）以增强连续可调谐红外激光器（频率范围：2000 cm^-1 至 1600 cm^-1，PL3 CO气体激光器，Edinburgh Instruments，英国）在样品表面附近的散射。采用氦氖激光器（Melles Griot，美国阿尔伯克基）作为不可见红外辐射的引导光束。红外激光在通过ZnSe部分反射镜后传播至透镜，并聚焦于振荡AFM探针的尖端，激光偏振方向与探针长轴平行。由透镜收集的红外辐射随后与参考的零差信号叠加。使用抛物面镜将红外辐射聚焦至汞镉碲（MCT）红外探测器（Graseby Infrared，美国奥兰多）。利用压电驱动器（Thorlabs，美国纽顿）调节零差光的相位，以最大化检测信号。上述大部分光学元件均牢固固定于平台上，并通过平移台在X、Y或Z方向进行位置调节。检测信号的交流分量被传输至锁相放大器（型号SR844 RF，Stanford Research Systems，美国森尼韦尔），在探针振荡频率下对信号进行解调。当AFM探针扫描样品表面时，可同步观测散射强度并获取表面形貌数据。数据与图像采集所用软件为Nanoscope V5.31r1（Veeco Instruments，美国圣塔芭芭拉）。

方案1

图1 - 展示了成像系统的各个组成部分，我们将描述其组装和使用方法

0) 光学平台
1) 多模式原子力显微镜（MM AFM）底座
2) 多模式原子力显微镜（MM AFM）扫描器
3) 升高式光学面包板
(13" x 18" x 3/8", Thorlabs)
4) 导向反射镜（镀金，直径1英寸）
5) 带光圈和中心遮挡的光学管
6) 带硒化锌（ZnSe）部分反射镜的光学立方体
7) 用于在升降平台（17）上固定装置的光学管
8) 红外物镜
(焦距16 mm，数值孔径0.28，Ealing)
9) 用于收集背向散射光的光学管
10) 带离轴抛物面镜的立方体
(90°, 焦距5英寸, Janos)
11) 用于固定45°锗（Ge）板的立方体
12) 显微镜目镜（10倍）
13) 安装在XY平台上的针孔（0.5 mm）
14) 红外MCT探测器（Graseby Infrared）
15) 红外探测器前置放大器（交流和直流）
16) XY平台用于调节光束位置
17) 升降台用于聚焦光束
18) Z轴平台用于调节红外探测器位置
19) X轴平台用于调节红外探测器位置

一、 光学装置的初始组装

组装步骤 I.1

组装光学装置，调节反射镜，使氦氖（HeNe）激光束与光学平台平行（0），并位于光学面包板（3）上方约合适的高度（H）处，且距扫描器（2）中心的距离为（D）。

该高度 H 和距离 D 可根据样品在扫描仪（2）上方相对于光学平台的高度（H1）、期望的入射角（α）、面包板顶部相对于光学平台的高度（h）、光学立方体和红外物镜的几何尺寸（图1中的6和8）以及红外物镜的工作距离（以上各项总和为 d，此处 d=1"+2"+2"）进行估算

图2

H=H1+d*sin(α)-h

D=d*cos(α)

组装步骤 I.2

图3

图3： 移除立方体（5）中的分束器，并在立方体另一端连接延长的光学管（6），使氦氖激光束直接通过安装在管端的光阑。

组装步骤 I.3

图4

图4： 移除扫描仪（2）后，将带有光圈的长光学管连接至原红外物镜位置。插入ZnSe部分反射镜，使光束沿长光学管向下传播并导向样品。ZnSe部分反射镜的安装应确保HeNe光束照射到固定部分反射镜的光学立方体几何中心处的反射镜前表面。

图5

图5：旋转部分反射镜，使氦氖激光束通过闭合的输出光阑。由于部分反射镜的支架无法使其完全垂直固定，因此设有两个自行安装的调节螺钉，可用于调节光束的垂直方向。如有需要，请使用这些螺钉进行调节。

图6

组装步骤 I.4

图6。使用橡胶O型圈将抛物面镜安装在光学立方体中（见图5中的1）。通过拧紧螺丝，O型圈被压缩，从而实现对镜片的调节。

图7

使用附加的反射镜（图7中显示了一个），将HeNe激光束按图7所示引导至相反方向。调节光束使其通过之前使用过的光阑。该光束将用于调节抛物面镜。

图8

图8：将抛物面镜置于光学立方体（10）中，将光线反射至探测器位置。调节螺丝使光束通过位于立方体输出端的针孔（11），该位置将安装锗（Ge）窗口。当光束对准针孔后，将MCT探测器置于针孔附近。调节红外探测器的位置，使氦-氖（He-Ne）光束对准探测器的感应元件。将探测器向下移动约2 mm（由于锗窗口的作用，红外光束将相应下移）。

组装步骤 I.5

图9

图9：将带有锗窗片的支架插入光学立方体（11）中。具有抗反射（AR）涂层的锗窗片用作红外滤光片，同时允许对悬臂和样品进行可视化观察。安装目镜（12）。通过调节立方体（11）相对于立方体（10）的扭转角度，可将目镜指向所需方向。旋转锗窗片支架，使氦氖激光束通过目镜中心。

图10

图10：连接红外物镜（8）和原子力显微镜扫描器（2）。将光束挡板安装到光学管（5）的输出端。通过目镜观察氦氖激光束时，应使用保护滤光片。将样品置于扫描器上，并使氦氖激光束通过输入端光学管（5）。确保氦氖激光束足够宽，能够溢出光束挡板边缘。使用光束挡板的原因在于卡塞格林物镜仅收集来自光束外围的入射光。通过调节目镜的螺纹，可获得聚焦在样品上的氦氖激光束的清晰图像。

组装步骤 I.6

需要对抛物面镜进行最终调整。将输出端的小孔替换为位于抛物面镜焦点位置的可调光阑。取下锗窗和红外探测器（请标记红外探测器的位置！）。在可调光阑后方附加一个透镜，透镜与光阑之间的距离约为该透镜的焦距。此时应能通过透镜观察到已啮合的悬臂。调整抛物面镜的位置，使针尖末端通过闭合的光阑居中可见。注意，当氦氖激光束正确聚焦到针尖上时，会在针尖与其在样品表面的反射像之间产生明亮的闪光。重新安装锗窗，并调整其位置以便于直观观察悬臂。将可调光阑换回小孔，并注意由于锗窗引起的红外光束偏移，用于红外检测的小孔应偏离中心放置。将红外探测器放回先前标记的位置。

最后，调整红外光束的方向，使其与用于调谐的可见氦氖激光束共线传播。
此时，所有准备工作均已就绪，可进行常规调节。

常规调整：

调整步骤 A.1：

使用氦氖激光器进行对准

与不可见的红外光（约6μm）相比，使用可见的氦氖激光（632nm）进行准直更为容易。

HeNe 激光束和红外激光束的光路在可倾斜反射镜处汇合。当该反射镜向下倾斜时，HeNe 激光可通过；当反射镜处于工作位置时，红外激光束则传播至近场装置。若需单独调整其中一束光路，请使用位于可倾斜反射镜之前、且不与另一光路共用的两个反射镜。若不慎移动了其他反射镜，应首先尝试将其恢复至原始位置。

A.1.1. 使用两面镜子进行粗调对准

使用靠近氦氖激光器的两个反射镜，将光束沿光路通过所有光阑，直至近场平台。如果观察外差臂中的光束，应能看到类似日冕的光束轮廓（这是由于光学管中的光束阻挡器所致）。这表明光束已笔直地通过了各管体。

A1.2. 使用近场平台进行精细校准

安装原子力显微镜（AFM）探头，并将悬臂针尖接触样品表面。将氦氖激光束聚焦到成像悬臂的末端。如果此操作导致光束偏离输入光学管（5）中心，则重复调谐步骤 A.1 和 A.1.2，直至光束居中。

通过移动平移光学平台，调节反射式显微镜物镜，使光线聚焦在悬臂尖端的顶端，并在此处发生散射。

旋转物镜下方的锗镜（位于光学立方体中），并通过目镜观察。此时（或当锗镜从立方体中拉出时，在红外探测器上）由抛物面镜将光束聚焦。前后移动载物台，直至观察到样品表面针尖及其反射像的清晰图像。利用另外两个方向（上下和左右）将原子力显微镜针尖大致置于目镜视野中央。

通过显微镜观察原子力显微镜（AFM）悬臂及其针尖。再次提醒，观察氦氖（HeNe）激光束时务必使用保护滤光片。即使没有HeNe激光束，仍可观察到一些来自AFM距离控制系统的内部光源发出的红光。移动平移台的左右和/或上下位置，直到在针尖尖端出现明亮的红色闪光。如果对准情况较差，先将平移台移至AFM的左侧，然后缓慢向右移动。注意观察是否有红色反射光在反射性样品表面移动。如果仍未观察到红色反射光，再次将平移台向左移动，并以上下方向进行扫描。持续进行左右、上下的移动，直到在将HeNe激光束聚焦于AFM针尖尖端时观察到红色闪光为止。

A1.3. 将本振光场与散射光重叠

打开零差臂，通过目镜观察。可以看到一条直线上有三个或更多强度递减的光斑，这些光斑是由不同光学元件的前表面和后表面多次反射形成的。调节零差臂中的反射镜，使第二个光斑（从底部数起且强度次之）与针尖的明亮像重叠，此时针尖与其反射像恰好汇合。

A1.4. 放置检测器

移除锗镜后，氦氖激光束应朝向红外探测器所在的方向。在光学管后方，可观察到两个环状光斑。其中强度居第二的光斑应穿过红外探测器表面热防护箔片上的小孔，而强度最高的光斑应出现在该小孔的边缘处。

A1.5. 从一个样本切换到另一个样本

更换样品后，原子力显微镜探针不再处于与之前完全相同的位置，但通常不会偏离太远。由于差异通常不大，可从步骤 A.1.2 开始操作。

注意：如果对准不准确，请检查HeNe激光束是否仍能穿过所有光阑，并在AFM针尖上产生明亮的红色光点。有时您可能未注意到已触碰并因此移动了镜片的原始位置。如果对准情况仍然不佳，则很遗憾必须重新完成整个对准步骤。

调整步骤2：红外光束的校准

使用高功率（至少100 mW）的CO激光线，这将使准直更容易。用液氮填充探测器，并使其平衡至少30分钟。

2.1. 使用两面镜子进行粗调对准

将功率计放置在第一个光圈后方，以监测入射红外光束的功率。接着，调节位于可倾斜镜前的反射镜，以获得最高的功率读数。取下功率计并将其置于靠近近场平台的光圈后方，调节可倾斜镜直至获得最大功率读数。重复此步骤数次，以实现最佳调节。

2.2. 观察1f信号

必须将锁相放大器的参考信号设置为1F（外部），即原子力显微镜（AFM）的振荡频率，以分离针尖振荡频率。在Nanoscope软件中，将力曲线模式下的扫描尺寸设置为3 μm。在完成2.1节中的粗调后，观察1F信号是否呈现正确的波形。接下来，通过调节压电驱动器，调整从针尖收集的散射光与来自零差臂的零差光之间的相位。该压电驱动器用于驱动零差臂中的镜面，通过改变压电元件的电压，使1F信号的第一个极小值出现在距零点约500 nm处。由于每次调整光路对准时都会改变两束光路径的长度，从而改变它们之间的相对相位，因此需要使用压电元件对相位进行校正。

你将观察到什么（1f 信号）？
对准不良：	在 3 μm 的 z 扫描范围内将观察到两个峰。
中等对准：	第一个峰的曲率略微呈现凹面大于凸面，且第二个峰比第一个峰小。
（接近）良好对准：	将观察到两个峰。第一个峰高于第二个峰，且第一个峰右侧的曲率为负（凹面）。

如何进行准直？
准直效果差：	根据需要重复步骤2.1中的准直操作。由于红外光束的直径较大，即使未完全准直，大部分光束仍能通过光阑。即使仍观察到两个峰，也可通过调节一个或两个准直镜来增强1F信号。注意观察第一个峰曲率的微小变化。最重要的是保持耐心，因为这是准直过程中最困难的部分。
中等准直效果：	尝试调节一个或两个准直镜以获得接近良好的准直效果。也可尝试移动XYZ平移台，但调节时必须使用极小的步长。
（接近）良好准直：	调节镜片，并尝试提高第一个峰的最大值。对于低输入功率，1F信号通常在8至16 V之间，信号会更低。通过压电驱动器改变电压来调节相位，使第一个最小值更接近零。如果存在明显的1F信号，切换锁相放大器的参考信号以分离出2F信号。应能观察到部分信号，并可通过极轻微地调节镜片和改变相位进一步优化信号。

2.3. 从一个样本更换到另一个样本

在HeNe光束准直条件下执行步骤A.1.5。启用AFM探针，并使红外光束通过显微镜。观察1F信号。如果仍然观察到1F信号，则调节可倾斜镜并调整相位。此时仍可能观察到良好的IF信号，从而获得良好的2F信号。若未观察到，需使用步骤2.2进行光束的精细准直。

代表性结果：

样品制备 #21-31 肽段由匹兹堡大学生物技术与生物工程中心合成，并通过高效液相色谱法纯化（纯度 >95%）。为合成淀粉样纤维，向1 mM #21-31 肽段的18 MΩ水溶液中加入0.8 mg TMAO（Sigma-Aldrich），该操作方法类似于Yang et al.^xiv所采用的方案。

制备了超平整金基底^xv。将40 μL存放一个月的溶液（室温孵育，pH 5.5）滴加到新鲜的超平整金基底上，静置数分钟。随后用18 MΩ水短暂冲洗，用流动的N₂气体吹干，并置于ANSIM仪器中。

图11展示了#21-31肽纤维的形貌和近场图像。A) 与相应近场图像同时获得的形貌图像。标签代表单个纤维，用于指示每根纤维所具有的二级构象类型。B和C) 在两个不同波数下采集的相应近场图像：1631和1691 cm^-1。每幅图像的面积为1 × 1 μm²。左侧标尺表示高度，右侧标尺表示来自锁相放大器的散射场。

图11