无孔径近场红外显微镜的组装、调谐与应用：用于蛋白质成像

摘要

本文描述了用于成像蛋白质聚集体的近场红外显微镜的组装方法。

摘要

本文旨在指导读者完成一种用于突破衍射极限成像的红外近场显微镜的组装与操作。该无孔径近场显微镜是一种基于光散射原理的仪器，可实现约20 nm空间分辨率的红外光谱成像。文中提供了完整的组件清单及分步操作流程。讨论了组装与仪器调谐过程中常见的错误。展示了一组代表性数据，呈现了淀粉样纤维的二级结构。

方案

背景：

无孔径探针近场红外显微技术可实现高空间分辨率成像。这是一种相对较新的技术，其原理是：一束入射红外光被一个在悬臂共振频率下振荡的尖锐原子力显微镜（AFM）探针尖端散射，该探针靠近样品表面。红外探测器收集散射光，并在该共振频率或其谐波频率下进行解调。通过这种方式，可以显著降低聚焦激光束照射样品其他区域所产生的背景散射，从而实现远超光衍射极限的空间分辨率，获得具有纳米级空间分辨能力的红外对比图像^i,ii,iii。由于AFM探针尖端的尺寸远小于激光束的聚焦区域，所产生的散射光信号非常微弱。为了增强这一散射场，通常采用外差检测技术，即在收集到的散射场中加入一个参考场，并调节两者的相对相位，使探测器处产生最大程度的相长干涉。此时，散射强度与参考电场的幅值成正比^{iv, v, vi}。在近场成像中，一个重要的问题是避免由AFM探针z方向运动所引起的伪影^{vii, viii, ix, x, xi}。如Mueller et al. 此前所示，通过适当调节外差相位并排除显著的形貌特征，可减轻这一问题。该技术已可靠地用于获取材料的实验散射光谱，空间分辨率优于30 nm₁₅。近场显微技术在生物材料上的应用也已有先例，特别是针对烟草花叶病毒^xii和大肠杆菌（E. Coli）^xiii等大分子的研究。

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