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用于组织工程与细胞培养的电纺纤维聚合物支架

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DOI：

10.3791/1589

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2009年10月21日

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1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

本文介绍了用于组织工程和细胞培养的聚合物电纺丝技术。具体描述了具有光反应性大分子单体的电纺丝过程，以及进一步的光图案化和多聚合物电纺丝加工能力。

摘要

随着组织工程领域的发展，人们迫切需要开发出更合适的材料和加工技术，以满足更为复杂器官和组织在力学性能和血管化等方面的需求。静电纺丝是一种常用的技术，可用于制备模仿天然细胞外基质结构和尺寸尺度的纤维支架。这些纤维支架也可用作细胞培养基质，因为纤维能够引导细胞行为，包括干细胞的分化（详见 Mauck 的全面综述）等和 Sill等有关更多信息）。在本文中，我们描述了聚合物电纺丝的一般过程，并以一个实例说明如何电纺一种具有光交联能力的反应性透明质酸（参见 Ifkovits等有关光交联材料的综述，请参见相关文献。我们还介绍了进一步的加工能力，例如光图案化和多聚合物支架的形成。光图案化可用于制造具有通道和多尺度孔隙结构的支架，以增强细胞浸润和组织分布。多聚合物支架有助于更好地调节支架的性能（如力学性能和降解性能），包括为细胞浸润定制的孔隙率。此外，这些技术还可拓展应用于多种聚合物和反应性大分子单体，以构建复杂的支架结构，提供实现成功组织工程构建体所必需的生物学信号。

方案

A. 单一聚合物静电纺丝

  1. 在配制静电纺丝溶液之前，将光引发剂Irgacure 2959（I2959）溶于去离子水中，于37°C条件下搅拌数天，制成0.5 wt%的溶液。若未使用光反应性聚合物，则此步骤可省略。
  2. 将甲基丙烯酰化透明质酸（MeHA，合成方法参见Burdick et al.）、聚环氧乙烷（PEO，900 kDa）和I2959溶于去离子水中，配制终浓度为2 wt% MeHA、3 wt% PEO和0.05 wt% I2959的溶液。使用涡旋振荡器混合至溶液澄清。此步骤中可根据所需支架特性调整聚合物种类与浓度以及所用溶剂。
  3. 将溶液转移至注射器中，并在末端安装一根18号、6英寸长的平头针头。
  4. 设定注射泵以1.2 mL/hr的速率推注液体。将注射器和针头装入设备中。
  5. 将高压电源的接地端连接至收集装置。若需收集随机分布的纤维，使用平板金属板；若需收集取向排列的纤维，则使用以约10 m/s转速旋转的芯轴。将高压电源的正极导线连接至针头。静电纺丝装置的示意图见图1。
  6. 调节针头或收集装置，使二者之间保持15 cm的距离。
  7. 启动注射泵的液体流动。当观察到针尖出现液滴时，开启电源并将电压设定为22 kV。
  8. 收集完成后（薄层薄膜需数分钟，较厚纤维膜可达24小时），从收集装置上取下支架，并在真空条件下干燥过夜，以确保溶剂完全去除。
  9. 采用扫描电子显微镜（SEM）观察纤维形貌，图1展示了取向排列与非取向排列结构的代表性支架。

注意：样品流速、收集装置距离和电压取决于聚合物与溶剂的组合，必须针对每个系统进行优化，通常通过扫描电镜观察支架形态来实现。

B. 光交联与光图案化

  1. 从支架膜上切取 5 mm × 5 mm 的样品。
  2. 将每个支架放置在覆盖有铝箔的载玻片上，将光掩模直接置于支架上，再覆盖一张干净的载玻片，并用长尾夹夹紧两端，以完成交联前的准备。注意：每次可同时处理四个样品；若无需图案，可使用无图案的透明膜进行交联。
  3. 将组装好的支架置于氮气环境中进行吹扫。保持体系无氧至关重要，因为氧气可能抑制交联反应。
  4. 将支架组件放入氮气环境中，在波长为 365 nm、光强约为 10 mW/cm2 的平行光照射下处理 5 分钟。参见图 2中的示意图。
  5. 取出每个支架，放入 12 孔板中。
  6. 向每孔加入 2 mL 去离子水，用封口膜密封培养板以防止水分蒸发，并在 37°C 下孵育 24 小时。期间更换水三次。
  7. 在光学显微镜下观察孔隙形成情况（示例见图 2）。支架现已准备就绪，可供使用。

注意：许多类型的聚合物不需要光交联，但光图案化只能用于光反应性聚合物。

C. 双聚合物静电纺丝结合荧光纤维可视化

  1. 将 PEO（200 kDa）溶于 90% 乙醇中，配制 5 wt% 的溶液。在静电纺丝前，于 50°C 下以 700 rpm 的速度搅拌至少 2 小时。
  2. 将 PEO 溶液转移至注射器中，并加入 DAPI，使电纺溶液中 DAPI 的终浓度为 10 mg/mL。用铝箔包裹注射器以避光。
  3. 配制与步骤 A2 相同的溶液，但额外加入甲基丙烯酰氧乙基硫代氨基甲酰基罗丹明 B（MeRho，683.24 g/mol），使电纺溶液中 MeRho 的终浓度为 25 μM。用铝箔包裹注射器以避光。
  4. 小心使用透明胶带将甲基丙烯酸化玻璃盖玻片（参见 Khademhosseini et al.）固定在收丝辊表面。注意：纤维将锚定在甲基丙烯酸化玻璃盖玻片上。
  5. 取一段长度为 5 mm、带有鲁尔锁扣接头的硅胶管，将其一端连接至其中一个注射器，另一端连接至针头。将注射器插入注射泵，并将针头穿过风扇上的孔。在收丝辊另一侧的注射器和风扇上重复此操作。风扇沿收丝辊长度方向移动，用于确保所得支架中两种聚合物的均匀分布。参见 图 3 中的示意图。
  6. 根据 表 1 适当调整第 A 节中所述参数。确保针尖位于收丝辊中心位置。

    表 1. 双聚合物静电纺丝参数
    注射器 风扇至针尖距离 (cm)针尖至收丝辊距离 (cm)流速 (mL/hr)施加电压 (kV)
    MeHA6151.2+22
    PEO6101.2+15

  7. 当所有部件正确对齐后，关闭光源，启动收丝辊和注射泵。移除注射器上的铝箔。当两个针尖处均可见液体时，同时开启电源并接通风扇电源。
  8. 收集完成后，关闭电源和收丝辊，并拔掉风扇电源。使用刀片小心移除盖玻片和胶带。
  9. 使用配备罗丹明和 DAPI 滤光片的荧光显微镜观察纤维。参见 图 3 中的示例。注意：荧光纤维在较短时间（<3 分钟）内电纺时最清晰可见，但此过程可无限延长以制备更厚的结构，尤其是在不使用玻璃盖玻片的情况下。

D. 在支架上接种细胞

  1. 将每个带有电纺聚合物的盖玻片分别放入适当大小的多孔板的各个孔中。注意：通过在甲基丙烯酸化玻璃盖玻片上进行电纺丝，可清晰观察细胞与纤维的相互作用。此外，MeRho 可再次用于纤维的可视化。
  2. 将支架在 PBS 中孵育过夜，以确保完全去除溶剂及任何可能浸出的副产物。
  3. 从各孔中移除 PBS。
  4. 为对支架进行灭菌，将其置于超净台内的杀菌灯下照射 30 分钟。若对完整支架进行接种，则需将支架翻面，再置于杀菌灯下照射 30 分钟。
  5. 进行标准的细胞培养，并制备所需细胞密度的浓缩细胞悬液（例如，6,000 个细胞/cm-2）。例如，对于 22 mm × 22 mm 的盖玻片，使用 100 mL 细胞悬液。将样品放入培养箱中孵育 1 小时。
  6. 向每个孔中加入适量的细胞培养基。将支架重新放回培养箱中。
  7. 使用市售的活/死细胞染色试剂盒对细胞进行染色。注意：也可采用其他类型的细胞染色方法，如 DAPI（细胞核染色）和荧光标记的鬼笔环肽（用于显示肌动蛋白应力纤维），以实现细胞的可视化。
  8. 使用配备 TRITC 和 FITC 滤光片的荧光显微镜观察细胞和纤维。示例见图 4。

代表性结果：

静电纺丝方法、聚合物溶液装置；非取向与取向纳米纤维支架示意图。
图1. 示意图显示非取向支架（顶部）和取向支架（底部）的装置设置。展示了每种类型支架的扫描电子显微镜图像。比例尺 = 5μm。请点击此处查看图1的放大版本。

静电纺丝支架紫外光刻工艺、光掩模应用、图案化凝胶形成示意图。
图 2. 图案化方法示意图。通过在光交联过程中将光掩模置于光源与支架之间形成图案，随后洗去未反应的聚合物。光掩模及支架在成孔并冻干后的扫描电镜图像。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看图 2 的放大版本。

静电纺丝装置示意图，显示聚合物流速；纤维形成的显微图像。
图3. 多聚合物静电纺丝装置的示意图及所需加工参数，以及两种纤维群体混合物的代表性荧光图像（示例：红色MeHA和蓝色PEO），二者同时进行静电纺丝以形成多聚合物支架。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看图3的放大版本。

显示细胞的荧光显微镜图像，绿色荧光标记突出显示蛋白质表达。
图4. 人源间充质干细胞及其与电纺纤维相互作用的活/死染色示例图像。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看图4的放大版本。

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讨论

采用静电纺丝技术从聚合物制备纤维支架。以透明质酸为基础的光交联支架作为示例，其交联过程需要光照。通过使用反应性大分子单体（如MeHA），并在光交联过程中使用掩膜，将先前已证明可增强细胞分布的通道结构引入支架中，从而形成宏观和微孔支架。此外，利用我们自行设计的装置，可同时进行两种不同聚合物的静电纺丝。通过在每种纺丝溶液中添加荧光染料，并随后使用荧光显微镜观察，验证了两种不同纤维群体的存在。与单一聚合物静电纺丝支架相比，多聚合物支架可用于增强细胞分布，并更精确地调节支架的力学性能和降解特性，以适应特定应用需求。此外，已成功实现支架的灭菌及细胞接种。上述多种技术具有良好的通用性，可用于多种不同聚合物，以制备适用于组织工程和细胞培养的多样化支架。

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致谢

本工作获得了美国心脏协会博士前奖学金对 JLI 的资助以及美国国立卫生研究院基金 R01AR056624 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DAPI 试剂InvitrogenD1306
I2959试剂Ciba Specialty Chemicals
PEO 200 kDaPolysciences, Inc.17503
PEO 900 kDa试剂Sigma-Aldrich189456
Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B试剂Polysciences, Inc.23591-100用DMSO配制储备液
Live/Dead染色试剂盒试剂InvitrogenL3224包含Calcein（使活细胞呈绿色）和乙啶同源二聚体（使死细胞呈红色）
注射泵设备KD ScientificKDS100双聚合物纺丝需使用两台
电源设备Gamma High VoltageES30P-5W双聚合物纺丝需使用两台
电机设备Triem Electric Motors, Inc0132022-15必须连接至定制芯轴
转速计设备Network Tool WarehouseESI-330用于监测芯轴转速
带准直适配器的Omnicure紫外点光源固化系统设备EXFOS1000
硅胶管设备McMaster-Carr51135K151
鲁尔锁母接头设备McMaster-Carr51525K293
鲁尔锁公接头设备McMaster-Carr51525K143
针头设备Fisher Scientific14-825-16H
盖玻片设备Corning2875-22

参考文献

  1. Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
  2. Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).
  3. Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).
  4. Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment. J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).
  5. Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration. Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).
  6. Sill, T. J., Von Recum, H. avon Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  7. Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity. , Forthcoming (2009).

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