我们描述了一种新型的红色荧光蛋白（RFP）报告基因，该报告基因特异性地在黑腹果蝇（Drosophila）眼部表达。本文详细介绍了眼成虫盘的解剖方法，以及如何利用该报告基因辅助解剖并鉴定发育过程中眼部的特定细胞类型。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
TheDrosophila眼睛是研究神经发生、信号转导和神经退行性病变等领域的一个强大模型系统。利用该系统所取得的许多发现，都得益于发育过程中眼成虫盘中感光细胞分化所具有的时空特性。要使用该系统，研究人员首先需要学会识别并解剖眼成虫盘。本文描述了一种新型的RFP报告基因，可用于辅助识别眼成虫盘以及可视化发育眼中特定的细胞类型。我们详细阐述了从三龄幼虫中解剖眼成虫盘的方法，并说明了eye-RFP报告基因如何辅助这一解剖过程。该eye-RFP报告基因仅在眼部表达，可通过荧光显微镜在活体组织或固定后的样本中直接观察，无需信号放大。我们还展示了该报告基因可用于识别眼成虫盘内的特定细胞类型。本实验方案及eye-RFP报告基因的使用将有助于研究人员利用该Drosophila眼睛用于解决具有根本重要性的生物学问题。
方案
- 首先，在解剖显微镜下，将一滴 PBS 滴加至 Sylgard 培养皿中。
- 接着用解剖铲从试剂瓶或瓶子中取出数条游走期三龄幼虫，并将其放入 PBS 中。
- 开始解剖时，若为右手操作者，请用左手镊子夹住幼虫身体后三分之二处，再用另一把镊子夹住前端深色的口钩。
- 现在将两把镊子缓慢向相反方向拉动，使幼虫身体分离。口器部分应连同眼/脑复合体一起从身体其余部分分离出来。
- 若需对眼原基进行免疫荧光染色，此时应将组织置于冰上，在 4% 多聚甲醛/PBS 溶液中固定 30–45 分钟。随后用 PBST 洗涤四次，并用适当的抗体进行染色。
- 最简便的方法是直接在载玻片上进行眼原基的解剖。在载玻片上滴加一滴 PBS，用镊子夹住口器部分，将眼原基转移至 PBS 液滴中。
- 由于成虫盘组织呈半透明状，初时难以辨认眼原基。为便于识别，可使用具备荧光功能的解剖显微镜。利用眼-RFP 报告基因品系，可在球形视叶上方清晰观察到呈红色荧光的眼原基组织（图 1）。
- 若使用光纤冷光源，应将光线以倾斜角度照射至载玻片，以增强原基的对比度。眼/触角原基在后端通过视柄与视叶相连，在前端则通过触角原基发出的 stalk 与口器相连。
- 解剖眼原基时，用一把镊子夹住口器部分，另一把镊子将眼原基从幼虫脑组织中分离。随后将眼原基与口器部分分开。最后将口器部分从载玻片上移除，以免其阻碍盖玻片平整贴合。
- 完成所有眼原基的解剖后，轻轻倾斜载玻片，吸去多余的 PBS。然后滴加一滴 Vectashield 封片剂，并轻柔地盖上盖玻片。
- 此时样品已准备好，可使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜进行成像（图 2）。
代表性结果
正确解剖后，眼/触角成虫盘应平展地贴附在载玻片上，无任何脑组织等多余组织。眼成虫盘的背侧和腹侧极部呈弯曲状，容易发生折叠，但可通过共聚焦显微镜采集Z轴系列图像，并在投影时剔除这些区域来避免。尽管成虫盘为单层上皮结构，但由于细胞核位置存在差异，仍需通过Z轴系列投影以获得成虫盘的整体图像。图2展示了在共聚焦显微镜下拍摄的一个典型眼-RFP标记眼/触角成虫盘的投影图像。我们通常使用20倍或40倍物镜，以1 μm的层厚对成虫盘进行逐层扫描。眼-RFP报告基因定位于细胞核，因此图2中所示的模式代表了表达RFP的细胞的细胞核分布情况。
图1. 来自眼-RFP三龄黑腹果蝇幼虫的眼/脑复合体的初步解剖。 可见被轮廓标出的眼/触角成虫盘附着在口器（MP）上，并覆盖在脑的视叶（OL）上方。该图像使用荧光解剖显微镜拍摄，以显示眼成虫盘中的RFP表达。前方朝左。比例尺：300 μm。
图2. 眼-RFP报告基因在眼原基盘中的表达。 从眼-RFP幼虫中解剖获得的三龄幼虫眼原基盘（ED）/触角原基盘（AD），显示RFP表达（红色）。该原基盘经鬼笔环肽染色（绿色），标记顶面细胞表面，可见形态发生沟（箭头所示）。RFP在形态发生沟周围的前体细胞、光感受器细胞1、6、7以及晶状体细胞中表达。前方朝左。比例尺：25 μm。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
黑腹果蝇（Drosophila）眼成虫盘的解剖操作较为简单，但需要一定时间掌握。关键步骤在于识别眼成虫盘，并将其从幼虫脑组织上完整分离。使用本文所述的eye-RFP品系可更方便地识别眼成虫盘。可能的实验改进包括去除触角成虫盘或周边上皮膜，或保留视叶与眼成虫盘相连，以便观察光感受器神经元轴突进入脑部的结构。
眼特异性RFP品系是通过从pointed P2基因的第二内含子中克隆一段新颖的眼特异性增强子元件2，将其插入pRed H-Stinger增强子-报告载体3，并利用该载体构建转基因果蝇而获得的。该眼特异性RFP报告基因在特定的一类光感受器细胞（PRs）以及晶状细胞中表达（图2）。因此，该品系可用于检测目的基因是否在这些细胞类型中表达。眼特异性RFP品系可根据请求获取。
发育中的黑腹果蝇（Drosophila）眼睛是研究控制光感受器神经发生基因和分子通路的有力模型1。本文所述的方法和报告系统可用于进一步加深...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
本工作由伦敦国王学院和英国皇家学会资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
参考文献
- Doroquez, D. B., Rebay, I. Crit Rev Biochem Mol Biol. 41 (6), 339-339 (2006).
- Kaul, A. K., Craig, G. M., McNeill, H., Bateman, J. M. , Forthcoming.
- Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. Biotechniques. 36 (3), 436-436 (2004).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
