用于胚胎电子显微镜观察的样本制备 黑腹果蝇 胚胎心脏管

摘要

我们描述了一种用于晚期Drosophila胚胎的固定、包埋、切片及成像方法，以进行胚胎心脏管的透射电子显微镜观察。该技术可实现对心脏管腔以及衬于管腔内壁的基底膜的可视化观察。

摘要

形态发生Drosophila胚胎心脏管已成为研究胚胎发育过程中细胞迁移、细胞间黏附以及细胞形态变化的一个重要模型系统。研究这一结构面临的一个挑战是，由于心脏管及其管腔相对于整个胚胎而言尺寸较小，因此在整体标本中难以观察到心脏管的管腔以及对心脏管形成至关重要的膜结构特征。透射电子显微镜的使用可实现对这些结构的更高倍数观察，并可通过横切面分析胚胎，从而清晰地揭示管腔的大小和形状。在本视频中，我们将详细介绍晚期胚胎进行可靠固定、包埋和切片的操作流程Drosophila为了观察心管管腔以及细胞间连接和基底膜等重要的细胞结构，对胚胎进行处理。

方案

1. 在20 ml玻璃闪烁瓶中，新鲜配制2 ml固定液，其中含12.5%戊二醛的50 mM卡考基酸盐缓冲液（pH 7.4）。加入8 ml正庚烷并剧烈振荡，静置使两相分层。移除上层含饱和戊二醛的正庚烷相，转移至洁净的闪烁瓶中备用，此即为固定液。
2. 使用胚胎收集室（一种带有可拆卸网状插件的小篮子）收集0–20小时的胚胎。将胚胎浸入50%次氯酸钠溶液中2–3分钟以去除外层绒毛膜，直至胚胎浮至溶液表面。用ddH₂O充分冲洗，并用纸巾吸干胚胎。
3. 用镊子夹取覆盖有去膜胚胎的网状插件，将其放入固定液中，使胚胎从网中脱落。在4°C条件下，于旋转混合仪（Nutator）上固定胚胎1.5小时。
4. 准备一个底部贴有双面胶带的培养皿。用巴斯德移液管将胚胎从固定液中取出，并转移至培养皿的胶带表面。转移时保留极少量固定液，以防止固定液中的正庚烷溶解胶带粘合剂。轻摇培养皿使胚胎形成单层。将培养皿置于通风橱中，直至正庚烷完全挥发。加入足量含0.1% Tween20的PBS覆盖胚胎。在解剖显微镜下，用钝头钨针手动去除16期晚期胚胎的卵黄膜。用巴斯德移液管回收胚胎至1.5 ml微量离心管中。第5–7步均在此微量离心管中进行。
5. 用0.1 M卡考基酸盐缓冲液（pH 7.4）冲洗胚胎，然后在含1%四氧化锇的0.1 M卡考基酸盐缓冲液（pH 7.4）中室温后固定1小时。再用0.1 M卡考基酸盐缓冲液（pH 7.4）冲洗胚胎。
6. 采用梯度乙醇和丙酮对胚胎进行脱水处理：先用50%乙醇脱水10分钟，再用70%乙醇脱水10分钟；随后用90%丙酮脱水10分钟，再用100%丙酮脱水两次，每次10分钟。
7. 去除丙酮后，开始渗透处理：向胚胎中加入1:1的Epon-Spurr树脂与丙酮混合液。使用Pelco Biowave Pro微波仪在真空条件下处理3分钟。微波处理结束后继续施加真空压力5分钟。将1:1树脂-丙酮混合液更换为100% Epon-Spurr树脂，并再次在真空条件下进行微波处理。最后更换一次100% Epon-Spurr树脂，再次在真空条件下微波处理。
8. 用巴斯德移液管将胚胎从微量离心管转移至硅胶包埋模具中。将胚胎排列成一行，使胚胎后端与模具的锥形边缘对齐。在70°C烘箱中过夜烘烤。
9. 取出样品，准备切片。
10. 使用金刚石组织切片刀（Diamond Histo Knife）和Richert Ultracut E切片机开始切取1 μm厚的切片。注意记录首次切到胚胎切面的位置。从此位置起，继续向样品内部切进100 μm。用环状工具取下一小片切片，置于载玻片上。在加热板上短暂加热切片。滴加一滴亚甲蓝对切片染色。在光学显微镜下识别心脏管腔。
11. 使用金刚石超薄切片刀（45°角）和Richert Ultracut E切片机切取90 nm厚的超薄切片。将多层切片捞取至铜网上。
12. 将铜网在含3%醋酸铀酰的50%乙醇饱和溶液中染色10分钟，随后用双蒸水冲洗三次。然后将铜网置于含有NaOH颗粒的染色室中，在无CO₂环境下用铅柠檬酸染色液（0.04 g溶于10 ml双蒸水和100 ml 10 M NaOH）染色2.5分钟。染色后再次用双蒸水冲洗三次。
13. 使用JEOL 1200EX透射电子显微镜在80 kV条件下观察切片，并用AMT数字相机拍摄图像。

讨论

Drosophila 胚胎心脏管的形态发生已成为研究胚胎发育过程中细胞黏附和细胞形态变化的一个重要模型系统。研究这一结构面临的一个挑战是，在整体胚胎标本中难以观察心脏管的管腔。本视频展示的技术改编自先前描述的方法^1-2，已被证明能够高效且可靠地分析大量基因型在心脏管及管腔形成中的表型³。