活体解剖 黑腹果蝇 胚胎：通过抗体染色快速筛选突变体文库的优化方法

摘要

我们描述了一种简化的方法，用于制备特定基因型的黑腹果蝇（Drosophila）胚胎的“去膜”样本。该方法可高效地开展多种遗传筛选实验，同时能够清晰地观察晚期胚胎中的各种结构。

摘要

Drosophila发育至14到17阶段的胚胎可轻松解剖以制备“去脏器”样本。在这些样本中，中枢神经系统位于中央，两侧为体壁。许多不同的表型已通过此类样本得到检测。大多数情况下，去脏器样本是通过对经抗体染色并固定的全胚胎进行解剖而获得的。然而，这些“固定解剖”样本存在一些缺点：操作耗时，且难以从利用GFP平衡染色体维持突变的品系中筛选出突变型（GFP阴性）胚胎。自2002年以来，我们课题组一直在开展缺失突变和异位表达筛选，以鉴定孤儿受体的配体。为此，我们开发了高效的活体胚胎解剖及抗体染色流程，适用于包含数百个平衡品系的样本集合。我们得出结论：通过活体解剖来检测大量品系集合中的表型，比固定解剖显著更高效。根据本文所述方案，一名经过训练的操作者每天最多可筛查10个品系的表型，对每个品系的4至7个突变胚胎在复式显微镜下进行观察。由于每个品系最多可对70个半节段使用40倍水浸物镜在高倍镜下进行评分，因此能够识别出具有细微且外显率低的突变表型。

方案

引言

果蝇 发育至14到17阶段的胚胎可轻松解剖，制备成“去内脏片状”样本。在此类样本中，中枢神经系统（CNS）位于中央，两侧为体壁，消化道已被去除。经抗体染色后，此类片状样本可显著改善中枢神经系统及体壁结构的观察效果例如 运动轴突、肌肉、外周感觉（PNS）神经元、气管）比整体胚胎更清晰，因为样本与盖玻片之间无组织阻隔，且幼体呈扁平状，可使跨越体壁的结构在单一焦平面内被观察。已有多种不同表型通过此类样本得到分析。大多数情况下，这些样本是通过对经固定和抗体染色的整体胚胎进行解剖制备而成。固定样本的制备步骤如下：1）用次氯酸钠去除卵壳；2）用多聚甲醛/庚烷固定；3）用甲醇去除卵黄膜；4）通过免疫组织化学或免疫荧光进行抗体染色；5）用甘油透明；6）使用钨针进行解剖。有关此类“固定后解剖样本”染色的详细方案见参考文献[1]。

固定解剖样本存在一些缺点。首先，在使用GFP平衡染色体进行突变平衡的品系或杂交中，即使使用抗GFP抗体进行检测，也常常难以将固定的、染色后的突变体（GFP阴性）胚胎与平衡子代区分开来。这由多种因素导致，包括GFP的母源表达。例如，我们发现，使用肌动蛋白-GFP（actin-GFP）或臂蛋白（armadillo, arm）-GFP平衡染色体时，几乎无法从平衡的第三染色体品系中分离出固定染色后的纯合突变胚胎。其次，制备高质量的固定解剖样本非常耗时，大多数人每小时仅能完成10至15个样本。第三，某些抗体在固定解剖样本中的染色效果不佳，原因可能是抗体表位对固定敏感，或因为能同时识别内部和外部结构的抗体被外部结构“吸附”而无法渗透至内部结构例如 抗fasciclin III（Fas3）抗体。第四，利用受体融合蛋白进行活体染色以检测配体表达时，无法在固定样本上进行。

自2002年以来，我们课题组一直通过缺失（Df）和异位表达筛选来鉴定RPTP配体。为此，我们建立了高效的操作流程，用于对包含数百个平衡品系的果蝇品系库进行活体胚胎解剖和染色。利用受体融合蛋白对孤儿受体配体进行染色是一种特殊技术，目前仅有少数课题组采用。然而，许多实验室普遍使用抗体染色法对剥离的幼虫肌片进行染色，以观察胚胎表型。在开发这些方法的过程中，我们发现，与固定后的解剖相比，通过活体解剖来分析大量品系的表型要高效得多。我们已利用活体解剖技术，对600多个缺失品系中的运动轴突、中枢神经系统（CNS）和肌肉表型进行了表征，同时还分析了异位表达400多种不同的细胞表面蛋白和分泌蛋白所导致的神经系统表型（A.W. et al. 在撰写中；H-K. L. et al.，在撰写中）。

多年来，我们所采用的活体解剖方案不断改进和完善。其中一位作者（K.Z.）在20多年前首次接触到活体解剖技术，当时Nipam Patel是Corey Goodman实验室的一名研究生，向其介绍了该技术。近年来，我们曾利用该方法通过抗Fas3抗体对中枢神经系统进行染色[2]，但其余所有实验均采用固定后的样本解剖。1999年，当时我们团队的博士后Aloisia Schmid引入了使用玻璃针进行活体解剖的方法，她将其用于分析注射双链RNA胚胎的表型[3, 4]。几年后，当我们开始进行RPTP配体筛选时，我们对该方法进行了改进，以实现对维持在GFP平衡染色体上的大量果蝇品系的快速分析。我们发现，即使存在较强的母源性GFP表达，仍可轻松地从GFP平衡品系中筛选出GFP阴性的胚胎。例如 对于TM3armGFP平衡染色体），因为胚胎是活体分选的，GFP表达的细微差异可以很容易被检测到。我们成功进行的针对Lar配体的缺失突变（Df）筛选详见文献[5]。

根据我们目前的实验方案，一名经过训练的操作人员每天可对5至10个品系进行表型筛选，每个品系在复式显微镜下观察4至7个突变胚胎。在完成胚胎的挑选与排列后，解剖50个胚胎大约需要一小时。该方法使我们能够识别出具有微弱且外显率较低的突变表型，因为每个品系最多可对70个半节段使用40倍水浸物镜在高倍放大下进行评分。这类表型若在解剖显微镜下对染色的整体胚胎进行筛选，则很难甚至无法被检测到。

我们已定义了一套用于表型筛选的缺失（Df）试剂盒，其中包含约250个品系，覆盖了约一半的基因组（A.W. et al., 正在准备中）。该试剂盒的开发始于我们对2002-2003年期间布卢明顿Df试剂盒进行的筛选工作，旨在鉴定RPTP配体合成所必需的基因[5]。在此筛选过程中，我们用发育状况更佳、优选已进行分子定位的小片段缺失（Df）品系，替代了原布卢明顿试剂盒中Df/Df纯合子无法发育出中枢神经系统（因而无法用于检测中枢神经系统配体表达）的缺失品系。

我们表型筛选试剂盒中的 Df/Df 纯合子品系在 16 阶段具有正常的总体形态，使研究人员能够系统地筛选影响中枢神经系统（CNS）、外周神经系统（PNS）、肌纤维、气管网络以及许多其他组织发育的基因。在 14 至 16 阶段，任何可通过特异性抗体或 GFP 标记可视化观察到的结构、表达模式或亚细胞定位模式，均可利用该试剂盒进行表型筛选。这意味着，按照本文所述方案，一人将约一半工作时间投入该项目，便可在六至十二个月内系统地筛选出所有黑腹果蝇（Drosophila）基因中约一半基因的特定胚胎表型。

A. Drosophila 胚胎收集

1. 准备“五管”卵收集装置

在检测大量果蝇品系时，这些装置可节省时间和精力。

1. 将五个50 mL的锥形管倒置在100 × 15 mm塑料培养皿的底座上，并使用硅橡胶粘合密封剂将管子相互粘合固定。
2. 待胶水固化后，将培养皿的底座部分粘合到锥形管的锥形末端。五个锥形管将直立于培养皿内部。
3. 使用加热的针头在管壁上打孔，以实现空气流通。

2. 准备卵收集板

1. 在每个 100 × 15 mm 的塑料培养皿中倒入约 7 mL 的葡萄琼脂凝胶（1%）。凝胶的理想厚度约为 3–4 mm，可密封每支锥形管并提供 24 小时的湿度。若凝胶过厚，在更换培养皿时可能脱落。
2. 待凝胶冷却后，盖上皿盖，并将其放回原始的塑料培养皿袋中。将袋口紧密封好，于 4°C 保存。

3. 准备果蝇

1. 为了获得足够数量的卵以便于挑选处于正确发育阶段的胚胎，我们尽量将 >50 只处女蝇与 >20 只雄蝇一起放入杂交管中。
2. 若需对杂交后代进行筛选，将雄蝇和雌蝇混合后置于装有果蝇培养基的管中，管底放置大量干酵母颗粒，并在培养基中央插入一条薄纸条（10 × 100 mm，对折）。纸条可增加产卵表面积，并防止果蝇接触过多湿气。
3. 将装有果蝇的管子在室温下至少放置 3 天。
4. 若需筛选来自培养瓶的品系，只需将果蝇转移到收集室中即可。

4. 将果蝇转移至五管产卵收集装置中。

1. 标记每个卵收集室的桶。
2. 为每个桶在卵收集板上放置酵母糊。
3. 准备一条20英寸长的标签胶带，用于将收集室和培养板固定在一起。将每端折叠10毫米，便于更换培养板。
4. 向果蝇培养管中注入CO₂气体，并将果蝇转移至已标记的桶中。
5. 用卵收集板盖住收集室，并轻轻压紧。
6. 从琼脂板中部开始，用胶带将收集室和卵收集板缠绕固定，胶带将覆盖在卵收集板上。

5. 收集胚胎

1. 准备收卵培养皿：在每个桶对应的收卵培养皿上放置酵母糊。
2. 轻敲使果蝇落入收卵室，并移除收卵室周围的胶带（需紧紧握住旧培养皿）。
3. 再次轻敲使果蝇落下，将旧培养皿更换为新的培养皿。
4. 以倾斜位置收集胚胎 2–4 小时。
5. 在预定时间更换收卵培养皿。

6. 培养胚胎

将卵收集板倒扣在含有湿润的90 mm圆形滤纸的培养皿上，并置于所需温度下孵育。对于从平衡突变系中分离16期胚胎的操作，我们通常在上午晚些时候进行收集，然后在19°C下孵育>22小时。在利用UAS/GAL4系统进行功能获得性研究时，我们在下午室温下收集胚胎，并在19°C下孵育16小时。次日将胚胎转移至29°C培养箱中，以激活UAS/GAL4系统，持续1至2小时。经过该时间段后，胚胎大多处于15期，这为根据GFP表达情况筛选胚胎并排列整齐提供了充足的时间，从而确保在进行解剖时胚胎处于16期。

7. 胚胎分期及根据GFP表达进行分选。

为了区分胚胎的基因型，我们使用GFP平衡染色体。在Olympus GFP体视显微镜下，利用双面胶带检查去壳胚胎（见下一节），同时根据胚胎发育时期和GFP表达情况对其进行筛选。

a) GFP 分选：

1. 我们使用的第2号染色体平衡子（CyOarmGFP）具有由armadillo启动子驱动的GFP，该启动子在表皮层中广泛表达。CyOarmGFP杂合子呈橄榄绿色，而CyOarmGFP纯合子则呈亮绿色。在CyOarmGFP品系中，缺乏该平衡子的胚胎很容易被区分，因为它们几乎不表达GFP（外观类似于无GFP平衡子品系的胚胎）。
2. 第3号染色体平衡子（TM3armGFP）在筛选时较难使用，因为它具有更强的母源性GFP表达。因此，胚胎可分为较绿和较不绿两类。经过一定练习后，通常可以较容易地区分这两类胚胎，但在转移至琼脂平板后，仍需进一步重新筛选：通过聚集胚胎并挑出那些比其他胚胎更绿的个体（即TM3armGFP杂合子）。否则，必然会出现部分基因型错误的胚胎。
3. X染色体平衡子为FM7 Kr-GAL4, UAS-GFP，其表达具有组织特异性。在15-16期用于筛选的相关表达模式包括羊膜血清层以及头部两处表达位点，即Bolwig器官细胞。遗憾的是，在需要进行胚胎筛选的时期，羊膜血清层的荧光正在消退，而Bolwig器官尚未开始发光。因此，必须非常仔细地观察胶带上的胚胎，常常需要将其翻转，以准确判断GFP表达情况，并且必须在琼脂平板上再次重新筛选。通常我们会进行两次筛选：第一次是在将所有胚胎从胶带转移至平板后立即进行，第二次则是在胚胎发育至适当阶段、准备排列进行解剖之前。有时，在将胚胎转移至PBS溶液后，我们还会在GFP荧光显微镜下重新检查载玻片，因为在这些条件下GFP的可视化效果更佳。随后，我们可在开始解剖前清除那些带有GFP的胚胎。

b) 分期

对14至16期左右胚胎进行分期的主要依据是肠道形态。在GFP显微镜下，肠道会发出自发荧光。例如，Hartenstein和Campos-Ortega的绿皮书），以便了解胚胎应有的形态。解剖的最佳时期是肠道已分裂为三条带状结构时。在此之前，肠道呈现为单一的团块状。通常先在团块阶段对胚胎进行分选，随后培养至适合解剖的最佳时期。过了三带阶段后，肠道尾部附近开始出现斜向条带，继而发生盘绕，胚胎整体也变得更加透明。在此之后，胚胎难以固定在载玻片上，导致解剖困难。若需解剖16期末期或17期早期的胚胎，则必须解剖大量样本，并评估不同肠道形态与胚胎能否粘附载玻片之间的关系。这种粘附性在不同基因型之间也存在一定差异。

B. Drosophila 胚胎活体解剖

1. 胚胎去壳
   1. 在载玻片上准备好双面胶带和葡萄培养板片
   2. 使用湿润的画笔将老化胚胎从收集板转移到双面胶带上，并将胚胎均匀铺开
   3. 用钝头解剖针在双面胶带上轻轻滚动胚胎以去除卵壳。去壳后，胚胎对针尖的附着力强于对其他胚胎或卵壳的附着力，但弱于对胶带的附着力；因此，可将胚胎在卵壳表面或其他胚胎上滚动，然后提起针尖将胚胎转移至葡萄培养板片上。在去壳和转移至针尖的过程中，同时进行基因型鉴定和发育阶段判定（详见上文描述）
   4. 按基因型和发育时期重新分类后，将胚胎转移至一块较小的矩形琼脂块上，其宽度应足以容纳每行排列10–15个胚胎。将去壳后的胚胎在此琼脂块上排列整齐：背面向下紧贴琼脂块，后端朝向操作者。通常每行排列5–10个胚胎
2. 准备载玻片并转移胚胎用于活体解剖
   1. 剪取一小块矩形双面胶带，将其置于Super Frost/Plus载玻片（Fisher Scientific，货号#12-550-15）一端附近
   2. 用石蜡笔在胶带周围画一个矩形（长约30–40 mm，宽度与载玻片相同），使石蜡线与胶带之间保留约3 mm间距（Super HT Pap Pen，www.rpicorp.com）。然后将载玻片倒置，轻轻压向葡萄培养板片上的胚胎，使胶带接触已排好队的胚胎（在解剖显微镜下操作）。胚胎应排列成后端朝向操作者，此时在载玻片上呈背面向上
   3. 立即在胚胎上方加入1×PBS（Gibco配方），使液体充满石蜡圈定的区域
3. 胚胎活体解剖
   1. 使用玻璃解剖针（由注射针制成），从胚胎后端开始沿背侧中线切开
   2. 用针尖轻刺胚胎前端，提起并转移胚胎直至其粘附于载玻片上。保持胚胎始终浸没在缓冲液中。在载玻片上按顺序排列胚胎，使其与琼脂块上的每行对应。合理组织各排，确保所有胚胎均能容纳在载玻片上
   3. 制作肌片时可采用多种不同的解剖顺序。通常研究者通过亲自实践发展出各自优化的操作流程。视频中展示了一种方法：首先在胚胎后端做一小切口，以分离两侧体壁。如有需要，也可通过此切口切断中肠/后肠连接，并将后肠移出至载玻片上（视频中后肠移除操作稍后进行）。随后，在脑叶后方两侧各做一切口，以分离体壁与脑组织。根据胚胎发育时期的不同，可能还需沿背侧中线做浅切口，以切断连接两侧体壁的羊膜-丝腺组织
   4. 然后，轻轻将体壁瓣贴附于载玻片上，避免拉伸或刮除其表面物质。最佳操作方式是仅让解剖针接触体壁背侧边缘的前、后两个角。由于运动神经轴突未延伸至此区域，在理想情况下可完整保留ISN分支。即使采用最佳技术，ISN仍可能被截断，因为胚胎并不总是精确沿背中线分离。若操作得当，该方法可保留T3–A6节段（约）的体壁结构
   5. 可暂时保留中肠覆盖在胚胎上方，在完成所有解剖后再统一移除。移除方法为轻刺肠道，将其从胚胎上推开，并拉伸以切断其与位于脑叶下方的前肠连接。或者，也可在每次解剖完成后立即移除肠道。对于肠道发育异常的突变体，建议在所有解剖完成后一次性移除肠道，因为破裂释放的卵黄可能影响后续从双面胶带转移的胚胎在载玻片上的粘附效果。有时从载玻片底部（靠近操作者一侧）开始转移胚胎更为有利，因为卵黄通常会随针的常规移动方向向操作者方向扩散
4. 固定与免疫荧光/免疫组织化学
   1. 此时，若使用抗体染色，可立即固定胚胎；若进行活体染色实验以检测配体表达，则可去除PBS并替换为融合蛋白上清液。本实验该部分细节详见参考文献[5]的方法与补充方法部分
   2. 此处描述固定流程，该流程可在立即固定或融合蛋白染色后进行。使用两支巴斯德移液管，将PBS替换为含5%多聚甲醛的PBS溶液（EMS，货号#15713-S，www.emsdiasum.com）。更换固定液三次，每次约使用6 ml固定液（因一支巴斯德移液管容量为1.5–2 ml）。固定45分钟
   3. 去除固定液，依次用PBS洗涤3次，再用PBT（PBS + 0.1% Triton X-100 + 1 mg/ml Fraction V BSA）洗涤3次，随后将PBT替换为约200 μl封闭液（PBT + 5%热灭活正常山羊血清），再替换为含所需一抗的封闭液。特别注意在PBS中操作时避免弯月面接触胚胎，否则会破坏解剖结构。加入去污剂后胚胎对弯月面的敏感性降低。因此，可通过倾斜载玻片并用Kimwipe纸短暂接触石蜡圈定区域的角落，吸除大部分液体，从而完成PBT到封闭液的更换。同样方法可用于封闭液到抗体溶液的更换，以最大限度减少溶液残留
   4. 4°C孵育过夜，然后在摇床上用PBT洗涤3次（>每次15分钟以上）（确保PBT量充足，使载玻片在整个震荡过程中始终完全浸没），按上述方法重新封闭，加入200 μl二抗，室温孵育2小时，再用PBT重新洗涤。如需，可在GFP解剖显微镜下观察染色情况（若使用绿色荧光）
   5. 用PBS洗涤2次（每次5分钟），然后加入500 μl 70%甘油/1×PBS（在50 ml离心管中混合35 ml甘油、5 ml 10×PBS和10 ml水），4°C避光过夜（或室温2小时）透明化处理。去除甘油后加盖#1盖玻片

讨论

我们希望本视频演示已充分展示了活体胚胎解剖与染色的方法细节，使任何具备一定黑腹果蝇（Drosophila）遗传学和胚胎学经验的研究人员都能轻松地重复该实验流程。当然，仍需要大量的练习，尤其是针对解剖操作本身。根据我们的经验，每位学习活体解剖技术的研究者最终都会发展出一套略有差异的解剖方案，从而能够最高效地获得高质量的阵列式解剖样本。这一过程通常需要数月时间才能完全掌握。然而，大多数人经过数周练习后即可制备出高质量的解剖样本。

尽管我们倾向于使用活体解剖进行筛选，但活体解剖无法完全取代固定解剖，因为固定解剖方案适用于更广泛的胚胎发育阶段。例如，在分析我们的Df试剂盒对运动轴突导向表型的影响时，我们发现通过免疫荧光染色活体剥离样本，能够比传统的辣根过氧化物酶（HRP）免疫组织化学染色固定剥离样本更清晰地观察到运动轴突分支的细节，包括丝状伪足（有关高质量HRP染色的示例，请参见我们实验室网页上的运动轴突导向实验指南）。然而，发育至17阶段初期以后的胚胎由于已形成角质层，无法牢固粘附于SuperFrost Plus载玻片上。因此，对于SNa等晚期发育运动轴突分支表型的定...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含丝硼硅酸盐玻璃管	Sutter Instrument Co.	BF120-60-10
Narishige PC-10型拉针仪	Narishige International		使用加热等级58.9进行玻璃管拉制