无透镜片上细胞成像技术为高通量细胞生物学与医学诊断提供了新工具

摘要

展示了无需透镜的片上细胞成像与表征技术。这种片上细胞成像方法为医学诊断和高通量细胞生物学应用提供了一种紧凑且成本效益高的工具，特别适用于资源匮乏的环境。

摘要

传统的光学显微镜通过物镜与其他透镜及光学元件协同工作来对细胞进行成像。尽管这种方法非常有效，但这种经典方法在将成像平台微型化以适应微流控技术先进水平方面存在一定的局限性。在本报告中，我们介绍了无透镜片上成像概念LUCAS（LenslessU超宽视场C细胞监测一个rray 平台基于S阴影成像）无需任何显微镜物镜或其他笨重的光学组件，即可对异质细胞溶液进行成像，视场超宽，最大可达约 18 cm²此外，与传统显微镜不同，LUCAS 能够在约 5 mm 的景深范围内对目标异质细胞溶液进行成像，无需重新对焦，对应的样本体积可达约 9 mL。该成像平台记录视场内每个目标细胞的阴影（即无透镜数字全息图），通过自动化的数字图像处理，可确定溶液中细胞的类型、数量及相对位置。由于无需任何笨重的光学元件或机械扫描装置，该平台显著实现了小型化，同时降低了成本，这对于即时诊断工具尤为重要。此外，该平台的成像通量比传统光学显微镜高出数个数量级，因此在高通量细胞生物学实验中具有极高的应用价值。

方案

本文讨论了LUCAS所涉及的实验步骤[1-3]。为了说明LUCAS的概念验证，我们将描述全血样本的成像过程。

A. 成像装置设置

LUCAS成像平台具有显著优势，可为现有的即时细胞分析和医学诊断工具提供一种经济高效且紧凑的替代方案，尤其适用于资源有限的环境。LUCAS并非直接检测细胞的图像，而是通过捕获由每个细胞散射光与背景光干涉形成的细胞数字全息图来实现成像。对照明部分空间相干性的精确控制对于实现全息记录至关重要。

1. 数字传感器阵列

LUCAS 平台利用光电传感器阵列对单个细胞的全息图进行数字记录。为此，可使用电荷耦合器件（CCD；样品型号：KAI-11002、KAF-39000，来自柯达）或互补金属氧化物半导体芯片（CMOS，样品型号：MT9P031，Micron）。柯达电荷耦合器件 KAI-11002、KAF-39000 和 Micron CMOS 图像传感器的像素尺寸分别为 9 μm、6.8 μm 和 2.2 μm，其有效视场（FOV）分别为 10 cm²、18 cm² 和 24.4 mm²。[1-2]

2. 光源

与其他大多数显微成像方式不同，LUCAS 不需要激光，因此甚至可以使用简单的发光二极管（LED）进行照明。为了实现可调波长的照明，我们还可以使用配备氙灯的单色仪（Cornerstone T260，Newport Corp.），并结合标准级熔融石英光纤，该光纤由一束光纤组成（77564，Newport），并在距传感器表面约 5–10 cm 处设置一个直径约为 100 μm 的针孔。这种可调波长照明配置提供了一个灵活的平台，可调节细胞的全息特征，并可合成混合数字特征，以提高信噪比，从而实现更准确和特异的表征。[3]

B. 样品制备与成像

将使用一种异质溶液演示基于芯片成像的LUCAS概念验证，具体方案如下所述。类似方案也可应用于多种其他细胞类型[1-3]。

1. 全血稀释及异质溶液的制备

1. 开始操作前，获取全血样本以及不同直径的聚苯乙烯微球（5、10 和 20 μm，Duke Scientific），并将所有材料恢复至室温。
2. 向一个无菌的 5 mL 聚丙烯管中加入 2 mL RPMI 1640 经典液体培养基（Fisher Scientific），作为稀释液。
3. 将全血样本孵育 30 分钟后，用移液器吸取 10 μL 沉降的红细胞样本，并转移至 RPMI 溶液中。
4. 向红细胞 RPMI 稀释液中加入总共 20 μL 的聚苯乙烯微球，通过轻柔吹打或使用磁力搅拌器配合搅拌子，充分混匀细胞悬液。
5. 取 5–15 μL 的混合溶液滴加到一片盖玻片上，再用镊子将另一片相同的盖玻片覆盖在溶液上方，使样品均匀夹在两片盖玻片之间。
6. 随后，使用真空笔（NT57-636，Edmund Optics）将样品加载至传感器阵列的成像活性区域进行成像。

2. 全血染色

1. 首先制备0.1%缓冲伊红Y与稀释新亚甲蓝溶液的混合液，所用试剂包括粉末型高纯度伊红Y（分子量=691.85，Acros Organics）、无锌高纯度新亚甲蓝染料（分子量=347.90，Acros Organics）以及一水草酸钾（99.0% ACS级试剂，Acros Organics）；每种溶液均使用孔径为0.45 μm的一次性注射器滤器（Whatman）过滤纯化，用于水相白细胞染色。
2. 然后，在聚丙烯烧杯中按1:1体积比，将溶解后的水相染色试剂与全血样本混合，并使用磁力搅拌器轻柔搅拌2分钟，随后静置孵育10分钟。
3. 取50 μL染色后的血液溶液转移至5 mL聚丙烯离心管中，加入1.95 mL RPMI 1640经典液体培养基（Fisher Scientific），使总体积稀释比例达到1:200。随后涡旋振荡稀释液30秒。此步骤中也可采用其他稀释比例。
4. 将10–100 μL染色后的细胞溶液滴加于盖玻片之间或微流控储液池内，然后使用真空移液笔（NT57-636，Edmund Optics）将样本转移至传感器阵列的活性区域。

代表性结果

图1： LUCAS 能够基于各种细胞和微小物体的二维全息特征，在无需使用任何透镜、激光器或其他庞大光学元件的情况下，实现对它们的精确定量和数字区分。本图展示了不同微小物体典型的 LUCAS 特征，并与采用 40 倍物镜获得的传统显微镜图像进行了对比。请点击此处查看图1的放大版本。

图 2：（左）包含红细胞、10 µm、5 µm 和 3 µm 微粒的异质混合物的原始图像。（右）同一视野下全自动 LUCAS 表征结果的示意图。请注意，该决策算法在表征高密度区域以及信噪比较低的微粒（如 3 µm 微珠）时均表现出良好的鲁棒性。

图3： 展示了LUCAS定制界面。基于Java的LUCAS软件允许输入多种实验条件，例如传感器像素尺寸或光的波长。用户还可以在图像上选择特定的视野，并自定义目标细胞模式，以构建统计学细胞阴影库。随后，可根据这些训练数据（即细胞阴影库）对获取的LUCAS图像进行表征，并将标记（计数）后的图像显示给用户。计数结果的统计信息也会以XML文件形式保存，供进一步分析使用。

讨论

我们已证明，LUCAS 平台能够基于微对象/细胞的全息特征，在芯片上准确计数并识别多种微小对象/细胞，为即时医疗诊断和高通量细胞生物学研究提供了有前景的工具。为了精确处理记录的全息图样，我们开发了一套定制的 LUCAS 决策软件。该算法利用通过 LUCAS 图像训练建立的统计衍射图像数据库，识别异质溶液中细胞的多种特征；对单个细胞的类型及其相对位置进行分类，并在应用阈值处理以剔除不需要的颗粒/细胞图样后，统计目标细胞类型的数量[1-3]。

总之，LUCAS 平台将为即时检验细胞计数和医学诊断提供一种经济高效且紧凑的解决方案。因此，LUCAS 尤其适用于资源有限地区对艾滋病患者的监测，以及其他与全球健康相关的问题，如疟疾和结核病。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电荷耦合器件 (CCD)	KODAK	KAI-11002
电荷耦合器件 (CCD)	KODAK	KAF-39000
互补金属氧化物半导体 (CMOS)	Micron	MT9P031
氙灯	Newport Corp.	Cornerstone T260
真空镊子	Edmund Scientific	NT57-636
5、10 和 20 μm 微珠	Thermo Fisher Scientific, Inc.	4000 系列
RPMI	Fisher Scientific	1640
纯伊红 Y	Acros Organics	MW=691.85
新亚甲蓝 (NMB) 染料	Acros Organics	MW=347.90
一水草酸钾	Acros Organics	99.0% 分析纯试剂 (ACS)