我们将展示如何使用吸管电极记录单个小鼠视锥细胞的闪光反应。
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本文内容
摘要
摘要
视网膜中的视杆细胞和视锥细胞负责光信号的检测。在暗环境中，外段的环核苷酸门控（CNG）通道处于开放状态，允许阳离子持续内流穿过细胞膜，从而使细胞去极化。光照会触发 CNG 通道关闭，阻断阳离子内向电流，从而导致细胞超极化。基于光感受器的这种电位特性，20 世纪 70 年代开发出一种吸吮记录法，与经典的膜片钳技术不同，该方法无需穿入细胞膜即可进行记录。1. 将外段吸入充满细胞外液的紧密贴合玻璃移液管中，可在曝光测试闪光时记录单个细胞的电流变化。然而，这种成熟的“外段吸入（OS-in）”吸吮记录法不适用于小鼠视锥细胞的记录，原因是小鼠视网膜中视锥细胞比例较低（3%），且难以识别视锥细胞的外段。最近，已开发出一种“内段吸入（IS-in）”记录构型，可将感光细胞的内段/核区吸入记录移液管中。2,3. 在本视频中，我们将展示如何使用单细胞吸液电极记录单个小鼠视锥细胞的光反应。
方案
制备电极
- 使用微电极拉制仪制备记录电极，并在显微镜下用加热丝对电极进行抛光。用于小鼠视锥细胞单细胞吸吮记录时，电极尖端的内径约为 6-7 μm。
- 制备参比电极。称取 1% 琼脂溶于蒸馏水中，在热水浴中熔化琼脂溶液。用注射器将 1% 琼脂溶液灌入玻璃毛细管（L = 100 mm，外径/内径 = 1/0.75 mm）。在室温下静置固化 10 分钟。
- 使用金刚石刀将毛细管切成两半。
- 将参比电极浸泡在参比溶液中，于 4 °C 下至少浸泡 24 小时。
实验设置
- 将小鼠置于黑色笼子中过夜进行暗适应。
- 配制100 mL参考溶液和1 L灌流溶液（见下文），并过滤溶液。
- 将0.1% BSA和10 mM葡萄糖溶解于20 mL参考溶液中。
- 使用光度计校准光学刺激器的光强。
- 将记录室安装在倒置显微镜的载物台上。
- 用95% O2/5% CO2气体饱和灌流溶液，并将其置于40 °C水浴中以增加CO2的溶解度。溶液从瓶中流经陶瓷电阻加热器，升温至36–38 °C后进入记录室。加热器应尽可能靠近记录室，理想位置为显微镜载物台上。
- 调节流量调节器，使流速约为....
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讨论
感光细胞的单细胞吸吮记录技术是在三十年前开发的。该技术使我们能够在不穿透细胞膜的情况下，记录由光刺激引起的跨膜电流变化。由于细胞间黏附性较高，从小鼠视网膜中分离出健康的单个视杆细胞和视锥细胞比从两栖类视网膜中分离更为困难，且由于视锥细胞比例较低（仅占3%）且体积较小，难以单独识别。内段记录（IS-in）方法通过记录多个感光细胞内段的电流克服了这一难题，其中可能包含视锥细胞。在野生型小鼠中，记录到的反应应为视杆细胞和视锥细胞反应的叠加。通过施加稳定的背景光可抑制视杆细胞的反应。在本视频中，我们使用了Tα-/-型视网膜，该视网膜中的视杆细胞因缺乏G蛋白转导素的α亚基6而无法对光刺激产生反应，因此所记录的光反应完全来自视锥细胞。
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致谢
由“防盲研究”职业发展奖、美国国立卫生研究院（NIH）资助项目EY 019312、以及“防盲研究”提供的无限制资助和EY 02687（华盛顿大学眼科与视觉科学系）支持。
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参考文献
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S. Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone....
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重印与许可
