我们将展示如何使用吸管电极记录单个小鼠视锥细胞的闪光反应。
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本文内容
摘要
摘要
视网膜中的视杆细胞和视锥细胞负责光信号的检测。在暗环境中，外段的环核苷酸门控（CNG）通道处于开放状态，允许阳离子持续内流穿过细胞膜，从而使细胞去极化。光照会触发 CNG 通道关闭，阻断阳离子内向电流，从而导致细胞超极化。基于光感受器的这种电位特性，20 世纪 70 年代开发出一种吸吮记录法，与经典的膜片钳技术不同，该方法无需穿入细胞膜即可进行记录。1. 将外段吸入充满细胞外液的紧密贴合玻璃移液管中，可在曝光测试闪光时记录单个细胞的电流变化。然而，这种成熟的“外段吸入（OS-in）”吸吮记录法不适用于小鼠视锥细胞的记录，原因是小鼠视网膜中视锥细胞比例较低（3%），且难以识别视锥细胞的外段。最近，已开发出一种“内段吸入（IS-in）”记录构型，可将感光细胞的内段/核区吸入记录移液管中。2,3. 在本视频中，我们将展示如何使用单细胞吸液电极记录单个小鼠视锥细胞的光反应。
方案
制备电极
- 使用微电极拉制仪制备记录电极，并在显微镜下用加热丝对电极进行抛光。用于小鼠视锥细胞单细胞吸吮记录时，电极尖端的内径约为 6-7 μm。
- 制备参比电极。称取 1% 琼脂溶于蒸馏水中，在热水浴中熔化琼脂溶液。用注射器将 1% 琼脂溶液灌入玻璃毛细管（L = 100 mm，外径/内径 = 1/0.75 mm）。在室温下静置固化 10 分钟。
- 使用金刚石刀将毛细管切成两半。
- 将参比电极浸泡在参比溶液中，于 4 °C 下至少浸泡 24 小时。
实验设置
- 将小鼠置于黑色笼子中过夜进行暗适应。
- 配制100 mL参考溶液和1 L灌流溶液（见下文），并过滤溶液。
- 将0.1% BSA和10 mM葡萄糖溶解于20 mL参考溶液中。
- 使用光度计校准光学刺激器的光强。
- 将记录室安装在倒置显微镜的载物台上。
- 用95% O2/5% CO2气体饱和灌流溶液，并将其置于40 °C水浴中以增加CO2的溶解度。溶液从瓶中流经陶瓷电阻加热器，升温至36–38 °C后进入记录室。加热器应尽可能靠近记录室，理想位置为显微镜载物台上。
- 调节流量调节器，使流速约为1–1.5 mL/min。
- 用参考溶液填充记录电极，将电极插入电极夹持器中，确保电极内无气泡。将夹持器安装在放大器的前置级上。将夹持器连接至吸力装置，该装置通过一段部分充满石蜡油的管路连接至电极夹持器的侧端口，管路另一端连接一个小型石蜡油储液池，可通过嘴部施加压力。
- 将参考电极连接至前置级的另一极。将热电偶（TC）固定在参考电极上，确保电极尖端与热电偶尖端尽可能靠近，以便温度读数能最接近细胞位置。
- 打开红外照明以观察电极。通过连接至显示器的红外相机观察电极，使用微操纵器将电极图像居中对准显示器视野中心。
- 调整参考电极尖端位置，使其靠近记录电极尖端（距离2–4 mm）。
- 调节加热器的直流电压，使溶液温度维持在约36–38 °C。
- 运行封接测试，检查记录电极的电阻，正常值约为900 kΩ。
分离小鼠视网膜
- 在微弱红光下，使用 CO2 和颈椎脱位法处死已暗适应的小鼠。用加热的金属灼烧笔尖端轻微烧灼巩膜最背侧点，以标记眼球。使用剪刀摘除眼球。所有后续操作均在红外光下进行。
- 在具有红外照明和图像转换器的显微镜下将眼球沿中线切开。
- 移除角膜和晶状体。尽可能多地去除玻璃体。
- 为记录 M-视锥细胞反应，根据灼烧标记，用剃刀刀片切除眼杯的腹侧部分4。
- 将视网膜从色素上皮层剥离。
- 展平视网膜并将其置于含有 1–2 mL 参考溶液的培养皿底部。
- 用剃刀刀片将视网膜切成小而薄的片状，并将制备物置于充满纯氧的避光盒中孵育。
记录
- 暂时关闭加热器。将灌流液切换至旁路管路，以防止记录室干燥。
- 使用一片Kimwipe纸巾吸除记录室中大部分溶液。用玻璃移液管将视网膜悬液转移至记录室中。
- 等待约2分钟，直至视网膜切片沉降稳定。恢复灌流液流速，并重新开启加热器。
- 打开红外照明以观察样本。在记录室中寻找一片外段朝上的视网膜组织（见示例图）。通过负压轻柔地将内段吸入电极中。在此配置下，应有多个细胞核和内段被吸入电极。记录细胞对强闪光的光反应，以检测电极中是否包含视锥细胞内段，并根据反应的动力学特征和幅度判断细胞是否健康。
- 降低矿物油储液池的位置，使电极尖端受到轻微负压，以帮助固定内段在电极中的位置。
- 找到状态良好的细胞后，记录从弱到强不同强度测试闪光的反应。测试闪光由经过校准的光学刺激器5提供。闪光强度和波长分别由一组中性密度滤光片和窄带干涉滤光片控制。测试闪光持续时间（20 ms）由计算机控制的快门调节。
溶液
- 小鼠灌流液：112.5 mM NaCl、3.6 mM KCl、2.4 mM MgCl2、1.2 mM CaCl2、10 mM HEPES（pH 7.4）、20 mM NaHCO3、3 mM Na琥珀酸盐、0.5 mM Na谷氨酸盐、0.02 mM EDTA 和 10 mM 葡萄糖。
- 小鼠记录电极液：140 mM NaCl、3.6 mM KCl、2.4 mM MgCl2、1.2 mM CaCl2、3 mM HEPES（pH 7.4）、0.02 mM EDTA。
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讨论
感光细胞的单细胞吸吮记录技术是在三十年前开发的。该技术使我们能够在不穿透细胞膜的情况下，记录由光刺激引起的跨膜电流变化。由于细胞间黏附性较高，从小鼠视网膜中分离出健康的单个视杆细胞和视锥细胞比从两栖类视网膜中分离更为困难，且由于视锥细胞比例较低（仅占3%）且体积较小，难以单独识别。内段记录（IS-in）方法通过记录多个感光细胞内段的电流克服了这一难题，其中可能包含视锥细胞。在野生型小鼠中，记录到的反应应为视杆细胞和视锥细胞反应的叠加。通过施加稳定的背景光可抑制视杆细胞的反应。在本视频中，我们使用了Tα-/-型视网膜，该视网膜中的视杆细胞因缺乏G蛋白转导素的α亚基6而无法对光刺激产生反应，因此所记录的光反应完全来自视锥细胞。
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致谢
由“防盲研究”职业发展奖、美国国立卫生研究院（NIH）资助项目EY 019312、以及“防盲研究”提供的无限制资助和EY 02687（华盛顿大学眼科与视觉科学系）支持。
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参考文献
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S. Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms. J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).
- Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
- Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation. J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).
- Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).
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