贴壁细胞培养用氧气插入装置的制备与操作

摘要

开发并验证一种附加式平台，该平台可对6孔板中的氧气空间和时间分布实现更精确的控制。该装置可适配多种培养系统，并可用于研究氧气对伤口愈合的影响。

摘要

氧气是多种细胞通路的关键调节因子，但目前允许in vitro氧气调控无法满足生物医学研究的需求。低氧培养舱为标准培养容器中的氧浓度控制提供了一种简单系统，但其无法对细胞表面的氧气浓度实现精确的时间和空间控制，因而限制了其在多种生理现象研究中的应用。其他系统虽在低氧培养舱的基础上有所改进，但操作需要专业知识和专用设备，使普通研究人员难以掌握。目前已开发出一种用于多孔板的微加工插入装置，可更有效地控制氧气浓度的时间和空间分布，从而更真实地模拟生理条件下存在的各种现象in vivo. 该平台由一个嵌入标准多孔板的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）插入件组成，作为被动式微流控气体网络，其带有透气膜，旨在调节向贴壁细胞输送的氧气。该装置使用简便，可连接提供压力的气体钢瓶，将所需浓度的氧气引入平台。制造过程结合了标准的SU-8光刻、复制 molding 以及在硅片上进行的可控PDMS旋涂。装置各组件经手持式等离子体系统进行表面处理后完成键合。验证通过平面荧光氧传感器实现。平衡时间在数分钟量级，可根据装置设计实现多种多样的氧浓度分布，例如本研究中实现的周期性分布，甚至可形成模拟体内存在的氧梯度in vivo. 该装置可通过常规方法进行灭菌以用于细胞培养，且不会丧失功能。该装置适用于研究in vitro将演示伤口愈合反应。

方案

1. 设备功能

1. 缺氧插件装置包含6个可嵌入标准6孔板的柱状结构。气体流入柱体，经过柱体底部的微流控网络，再从装置流出。在柱体底部形成微通道底壁的位置，设有一层厚度为100 μm的透气性PDMS膜，允许氧气在气体微通道与培养基之间扩散。因此，该装置通过建立浓度梯度，使培养基中的氧浓度趋向于设定的目标值。
2. 与传统的缺氧培养箱及其他细胞供氧系统相比，该装置具有多项优势：1）缩短氧气扩散路径，实现更快的时间控制；2）根据柱体微通道的设计，增强氧浓度的空间控制能力；3）占用实验空间更小，通量更高，可提高实验效率；4）可适配常规细胞培养工具（如多孔板），且无需特殊操作知识或专用设备。

2. 器件制备

1. 首先，使用先前加工好的Delran模具，通过PDMS复制模塑法制备柱阵列。
2. 接着，利用标准的SU-8光刻技术和PDMS复制模塑法，在每个柱的底部加工出气体微通道。
3. 通过在硅片上精确旋涂PDMS来制备透气膜，以获得所需的厚度。在本示例中，我们使用厚度为100 μm的膜，其制备条件为：先以500 rpm旋转10秒，再以900 rpm旋转30秒。
4. 所有组件在经过手持式等离子体设备（型号BD-20，Electro-Technic Products）进行氧气等离子体处理后，键合在一起。

3. 设备设置

1. 将装置轻轻插入培养板中，注意避免产生气泡。插入时倾斜装置有助于将气泡从一侧排出。在实际的基于细胞的实验中，此步骤必须在无菌超净工作台内进行。一旦装置插入到位，污染风险将显著降低，因此可在非无菌环境中将组装好的装置转移至培养箱。
2. 将气源钢瓶的管路连接至装置的进气口和出气口。对于基于细胞的实验，培养箱应设有允许管路穿过的孔洞，需在将装置转移并放置入培养箱后再连接管路。操作时需小心，避免对装置施加过大的压力，否则可能导致PDMS变形，进而压碎下方的细胞。
3. 在打开钢瓶顶部调节阀之前，确保精密流量调节阀处于关闭状态，以防止气体过量流入装置。启动气体流动后，缓慢打开精密流量调节阀至所需流速（50–100 mL/min）。在接下来的一小时内密切观察流量数值，并根据需要进行调整，因为系统达到平衡过程中压力会变化，从而影响流速。为避免培养基中产生气泡，在以较高流速平衡15分钟后，应将流速降低至10–20 mL/min。
4. 在达到预期实验时长后，停止气体流动，取出培养板，并根据需要对细胞进行相应处理（例如裂解、染色、计数等）。

4. 设备验证

1. 校准
   1. 选择荧光氧检测中检测位点的数量和位置
      （FOXY）传感器载玻片（根据验证需求而定），用于氧气测量。该载玻片含有荧光钌染料涂层，其荧光可被氧气淬灭。
   2. 将载玻片直接暴露于气体罐提供的0%、10%和21%氧气环境中，5分钟后采集图像以确保充分平衡。
   3. 导出每个位置的平均图像强度，并绘制氧合浓度随荧光强度变化的曲线。
   4. 通过将线性曲线拟合至0-10%线段和10-21%线段，生成校准曲线。
2. 异质性
   1. 在通道宽度范围内以设定的间隔（例如每1 mm）建立多个点。注意，根据间距的不同，图像之间可能会有重叠。
   2. 通过该设备测量孔板表面的氧气浓度
3. 平衡
   1. 在FOXY载玻片上选择三个点以测量氧浓度。
   2. 在环境氧浓度下采集第一张图像后，立即打开精密流量调节器，使气体通入装置。以适当的时间间隔采集图像，以评估氧浓度平衡所需的时间和程度（例如，每10秒一次，持续30分钟）。

5. 应用

1. 伤口愈合
   1. 实验前一天，将灭菌的PDMS插入物浸泡在无血清培养基中，以减少孔内气泡的形成。
   2. 在6孔板中将细胞培养至100%汇合度。
   3. 使用p200移液枪头在单层细胞上制造直线划痕，以模拟伤口。
   4. 吸除细胞培养基，用5 mL培养基冲洗一次，再吸除。注意不要扰动细胞单层。
   5. 向各孔中重新加入4 mL无血清培养基，以减少细胞增殖。
   6. 将插入物放入孔中，并将每个孔连接至相应的氧浓度环境。
   7. 将带有插入物的6孔板置于37°C加热载台上。
   8. 按设定的时间间隔和总时长拍摄细胞的延时图像。可使用MATLAB的T_Scratch（一种伤口测量算法）分析未愈合的表面积。

6. 代表性结果

1. 装置验证
   与低氧培养箱相比，低氧插入装置在氧气平衡时间和平衡程度方面均有显著改进，可在不到2分钟内稳定至0.5%氧气浓度。装置中膜与孔底之间的间隙大小是决定平衡效率的关键因素，较大的间隙需要更长时间才能达到稳态氧浓度值。该装置还可在单个孔内实现对空间氧浓度的精确控制，允许形成多种氧环境，甚至可在孔表面产生周期性氧浓度分布。
2. 伤口愈合
   将细胞单层暴露于10%或21%氧气环境中，并随时间分析伤口表面面积的变化。在21%氧气中划痕闭合最慢，而在10%氧气中闭合最快。图1显示了划痕在17小时内的图像变化。图5中的图表展示了实验期间两种氧浓度下开放伤口面积的百分比变化。

图1. 展示装置特征的示意图与图解。该氧气插入装置通过常规光刻技术（微流控网络）、复制模塑（微流控网络和插入支架）以及定义化的PDMS旋涂工艺（透气膜）制备而成。A) 氧气装置嵌入6孔板中的示意图。B) 24孔和96孔柱状阵列的示例。C) 柱状结构的横截面示意图。氧气通过入口流入装置，并在柱体底部的微流控网络中流动。氧气可自由穿过柱体底部的透气性PDMS膜，并溶解到培养基中。D) 从上方拍摄的单通道柱体的显微镜图像，显示其多种结构特征，包含用于平衡研究的键合玻璃柱。

图 2. 使用氧气传感器对装置进行验证。通过平面型钌基氧气传感器测定各孔内的氧张力。所有氧气混合气体均以氮气平衡，并含有5% CO₂ 以维持培养基的缓冲环境。A) 图示支撑柱高度（即膜与细胞之间氧气扩散距离）对平衡时间及效果的影响。高度由固定在装置底部的玻璃柱段控制。三种不同高度的支撑柱所达到的平衡时间均显著优于低氧培养箱。注意，时间轴为对数刻度。B) 图示0.2 mm间隙装置的快速氧气平衡响应时间。C) 还在微通道下方的孔内进行了多点线扫描，以确认装置引入的氧气浓度具有空间均一性。该图显示了分别灌注0%、10%和21%氧气10分钟后测得的氧气浓度。D) 该装置可在5天内有效维持10%的氧气浓度。

图3. 采用更复杂微通道设计的实验。A) 双条件微通道装置在14天内产生稳定的0%和21%氧气分布。B) 跨越支柱的500 μm宽交错蜿蜒微通道形成周期性氧气分布。需注意，由于微通道对准困难，数据仅展示一次代表性试验结果。

图4. 初始划痕后0、7和17小时的伤口闭合延时图像。实验全程细胞均在21%氧气条件下培养。

图 5. 划痕实验中氧浓度对伤口愈合速率的影响。

讨论

该装置采用标准的SU-8光刻、复制模塑以及定义旋转工艺制备，完全由聚二甲基硅氧烷构成。通过向装置中引入气体，在柱状微通道与培养基之间建立浓度梯度，从而驱动系统达到目标平衡氧浓度。研究表明，该装置能够有效调控孔内氧合的时间和空间分布，并相应调节细胞行为。氧合的空间模式由柱体底部的微通道定义，因此在制作光掩模时可实现多种设计。此外，将目标气体注入孔的气相部分，有望缩短平衡时间并增强缺氧程度。可通过在装置上集成微流控混合网络，利用少量储备气罐生成新型气体混合物。最后，引入培养基更换机制将消除从多孔板中取出装置的需要，避免因操作对细胞造成影响。

该设备可应用于任何需要控制氧气浓度的体外（in vitro）或离体（ex vivo）实验。由于氧气是影响绝大多数信号通路的重要生理变量，因此受益的研究领域仅受限于研究者的创造力。其中一些可受益于增强的氧气浓度时间控制的领域包括癌症转移、睡眠呼吸暂停以及心肌缺血再灌注损伤等。例如，间歇性低氧已被证实与更具侵袭性的癌症相关，相较于持续性低氧和常氧条件，其可上调多种与转移相关的基因。空间控制同样重要，因为氧浓度梯度在发育过程、肝脏分区、药物毒性以及干细胞微环境等过程中均起着关键作用。本文所介绍的设备将通过提供一种占用实验室空间更小、操作相对简便、且对细胞氧暴露条件具有更精确控制的系统，从而推动多个研究领域的发展。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PDMS-Sylgard 184	Dow Corning
平面FOXY传感器	Ocean Optics	FOXY-SGS-M	带涂层的显微镜载玻片
气体调节器	Omega Engineering, Inc.	FL-1472-G
气体	Airgas	定制混合气	均含5% CO2
SU-8 2150	MicroChem Corp.
含L-谷氨酰胺的MDCK生长培养基	SAFC Global	M3803
胎牛血清	ATCC	30-2020
胰蛋白酶-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
L-谷氨酰胺溶液	Sigma-Aldrich	G7513