使用赛默飞世尔科技 Solaris qPCR 检测试剂盒进行定量实时 PCR

摘要

Solaris qPCR 基因表达检测试剂盒是一类新型的预设计 qPCR 引物/探针组合，旨在简化 qPCR 操作流程，同时不牺牲检测的特异性和可靠性。

摘要

Solaris qPCR 基因表达检测试剂是一种新型引物/探针组合，旨在简化 qPCR 流程，同时保持检测的灵敏度和准确性。这些引物/探针组合已针对人类和小鼠基因组中 >98% 的序列预先设计，并在先前可用技术的基础上实现了显著改进。这些改进得益于赛默飞世尔科技公司生物信息学专家开发的一种新型设计算法。

Solaris qPCR 检测试剂中已整合了多项便捷功能，以简化定量实时 PCR 的操作流程。首先，该实验方案与常用的替代方法相似，因此 qPCR 过程中所使用的技术对操作者而言可能较为熟悉。其次，预混液呈蓝色，有助于更清晰地观察和追踪 qPCR 反应体系的加样过程。第三，所有检测（基因）均采用相同的热循环条件，使得多个样本可同时运行，降低了操作出错的可能性。最后，试剂提供了探针和引物序列信息，便于发表研究结果。

本文演示了如何通过订购网站（www.thermo.com/solaris）上的 GENEius 产品搜索功能获取相应的 Solaris 试剂，以及如何使用 Solaris 试剂通过标准曲线法进行 qPCR 实验。

方案

1. Thermo Scientific Solaris qPCR 引物设计算法

1. Solaris qPCR 探针/引物对的设计所采用的算法会调整每个组分的 Tm，从而实现通用的循环条件。在探针中引入 MGB（小沟结合）基团可提高其 Tm，使得能够设计更短的探针，从而增强检测的灵活性和性能。顾名思义，MGB 是一类可嵌入 DNA 双螺旋小沟的抗生素，可连接于 DNA 探针的 3′ 或 5′ 端。在溶液中，探针的 FAM 报告荧光被 Eclipse 暗淬灭剂所淬灭；当探针与靶序列结合后，其三维构象发生改变，从而产生强荧光信号。MGB 能够稳定 DNA 探针与靶序列的结合，使得在保持合适 PCR 熔解温度的同时，可使用高度特异性的短探针。因此，信号检测发生在靶标扩增的退火阶段。在延伸步骤中，MGB 探针解离，荧光再次被淬灭。由于探针在延伸过程中解离，不会影响 PCR 扩增效率。
2. Solaris 算法的另一特点是使用 Superbases（超级碱基）。Superbases 是经过修饰的碱基，具有增强的结合能力，可提高 A-T 碱基对的稳定性，并消除富含鸟嘌呤序列中的 G-G 自缔合现象。此外，它们不会淬灭连接在 5′ 末端的相邻荧光基团。根据算法，这些碱基被选择性地放置，以扩大可选靶序列的范围，使得原本在引物和探针设计中需避免的序列（如 G-C 富集区）也可被利用。
3. 在可能的情况下，Solaris 算法会在靶位点中纳入跨越外显子连接区的序列，从而避免扩增污染性的基因组 DNA，提高检测特异性。
4. 重要的是，该算法还能识别所有已知剪接变异体的共有序列，使得单一对探针/引物组合即可覆盖全部变异体，因此针对任一目的基因仅需一个检测体系。
5. 最后，Solaris qPCR 检测设计算法在关键设计参数上采用了极为严格的条件，包括 GC 含量、长度、Tm 值以及同聚物核苷酸的连续 stretches。所得序列通过 BLAST 分析在三个不同数据库（基因组、转录本和假基因）中进行特异性验证。

2. 获取 Solaris 试剂

1. 要获得适当的 Solaris 试剂，请访问 www.thermo.com/solaris
2. 进入网站后，点击“GENEius 产品搜索”。如需直接进入 GENEius 产品搜索页面，请访问 www.thermo.com/SolarisSearch
3. 单击搜索查询框，选择相应的目标生物体。
4. GENEius 产品搜索可处理多种不同的基因标识符。在此输入建议的搜索词之一以查找目标基因，包括 Ref Seq 登录号、基因 ID、基因符号、基因描述、Sanger ID 或登录号，或货号。然后，点击“搜索”。
5. 确定目标基因，然后点击左侧的“选择”。这将打开一个窗口，显示针对该目标基因提供的不同 Thermo Scientific 产品。在“产品”下选择“qPCR 检测”选项卡。
6. 在“Solaris 基因表达检测”标题下，您将看到一种经过优化设计的 Solaris 探针/引物检测。该检测可覆盖您目标基因的所有已知剪接变体。请选择所需数量，可选规格为 100、200、400 和
   1000 X 25 μl 反应（如果该检测被标识为定制产品，则不提供100次装规格）。点击“加入购物车”。
7. 接下来，为将要使用的热循环仪选择合适的预混液。要确定哪种预混液最适合可用的仪器，请点击“查找哪种预混液最适合您的PCR扩增仪！”
8. 在菜单中查找将要使用的qPCR仪，以确定应选用哪种预混液。
9. 返回 GENEius 产品搜索窗口，选择合适的预混液。预混液提供 100、200、400 和 1000 次反应规格。点击“加入购物车”。
10. 建议的参考基因和verso cDNA合成试剂盒也可一并订购，以完成完整的qRT-PCR分析。
11. 当 Solaris qPCR 试剂到货后，将其储存于 -20°C 待使用前保存。应收到以下试剂：一种20X溶液，内含两种引物（每种800 nM）和一种基因特异性探针（200 nM）；探针和引物的序列信息；以及2X浓度的Solaris qPCR基因表达预混液。Solaris qPCR基因表达检测试剂在至少12个月内保持稳定。避免反复冻融。

3. qPCR 反应体系的建立

1. 使用 cDNA 开始 qPCR 实验方案。应采用离心柱法提取总 RNA。推荐使用 Thermo Scientific Verso cDNA 合成试剂盒进行逆转录，以生成 cDNA。
2. 准备 qPCR 时，将引物、探针和预混液在冰上解冻。同时准备好 PCR 级水和不透明白色 qPCR 板，后者可提高实时 PCR 的灵敏度。
3. 预混液包含实时 PCR 所需的全部组分：1) Thermo-Start DNA 聚合酶，即 Thermoprime DNA 聚合酶的热启动版本。此类聚合酶用于防止反应体系建立过程中发生非特异性扩增，需在 95°C 活化 15 分钟；2) Solaris 预混液中的 dNTPs，其中 dTTP 取代 dUTP，以最大化扩增效率；3) 专有反应缓冲液，经优化可与 Solaris 引物/探针检测体系兼容。该缓冲液含有蓝色染料，可增强试剂与塑料表面之间的对比度；4) ROX，若您的 qPCR 仪器需要 ROX。
4. 待溶液完全解冻后，轻轻弹击管壁混匀（切勿涡旋）。短暂离心以避免试剂损失。
5. 接下来，准备一个 15 mL 无菌 Falcon 管，用于配制目的基因的反应体系，另设一管用于内参基因，根据样本数量相应放大体积。配制总量应足以对每个样本进行三个重复，并包括一个无模板对照（NTC）和标准曲线样本（若采用标准曲线法进行数据分析）。
6. 对于 96 孔板上的每个样本，混合以下组分：5 μL 的 2X Solaris qPCR 预混液、0.5 μL 的 Solaris 引物/探针试剂（20X）以及 PCR 级水，使加入 cDNA 后最终反应体积为 25 μL。对于 384 孔板上的每个样本，混合以下组分：12.5 μL 的 2X Solaris qPCR 预混液、1.25 μL 的 Solaris 引物/探针试剂（20X）以及 PCR 级水，使加入 cDNA 后最终反应体积为 10 μL。
7. 使用多通道移液器将预混液转移至板上的相应孔中。预混液中的蓝色染料有助于在白色板上追踪移液过程。随后，加入 1–5 μL cDNA 模板（适用于 96 孔板）或 1–2 μL cDNA 模板（适用于 384 孔板）。上下吹打混匀。将板放入离心机中短暂离心，以去除气泡，避免干扰荧光信号读取。
8. 设置 PCR 仪程序：酶活化需在 95°C 下进行 15 分钟（1 个循环），随后进行 40 个循环，每个循环包括：95°C 变性 15 秒，60°C 退火与延伸 60 秒。
9. 将板放入 qPCR 仪器中，启动程序。

使用 Solaris 的代表性 qPCR 结果

图1. 根据PCR扩增效率和r²值判断，Solaris检测试剂即使在极低起始浓度下也能实现可靠的检测。分别使用合成RNA扩增子序列或DNA扩增子序列反转录合成的cDNA进行10个10倍梯度稀释，随后在ABI 7900HT仪器上采用Solaris qPCR基因表达检测试剂盒对F2RL1或CDC20进行扩增。图中显示了对数尺度下的扩增曲线和标准曲线，以及各检测的性能指标，包括扩增效率、r²值、10个10倍稀释梯度所覆盖的动态范围，以及最低检测限。

图2. Solaris检测在不同研究人员和实验室之间仍能提供一致的结果。将靶向ALDOA和PPIB的siRNA以及非靶向对照（NTC）以100、10、1和0.1 nM的终浓度转染至HeLa细胞中。处理48小时后收集细胞并提取总RNA。使用Thermo Scientific Verso cDNA合成试剂盒合成cDNA。取部分cDNA，在两个不同地理位置的实验室中，利用Solaris qPCR基因表达检测试剂盒，在Roche LightCycler 480（384孔）平台上对ALDOA、PPIB和GAPDH进行扩增检测。基因敲低效率通过ΔΔCq法计算（以GAPDH为参照基因，NTC处理组细胞为对照）。在两个实验地点，两位研究人员均观察到对两个靶基因相似程度的敲低效果。

讨论

Thermo Scientific Solaris qPCR 检测试剂为执行 qPCR 分析提供了一种简单且改进的方法。这些引物和探针组采用高严谨性算法，并结合 MGB 技术和 Superbases，最大限度地提高了 qPCR 实验的保真度和稳健性。一组引物和探针可识别特定基因的所有已知剪接变体。靶标位点尽可能包含跨外显子区域，以确保基因组 DNA 不被扩增。这些特性使得能够同时运行大量样品，显著减少执行复杂实验所需的时间。由于预混液呈蓝色，因此可以使用白色不透明板，这提高了 qPCR 的灵敏度，同时不会影响加样追踪。

综合来看，Solaris qPCR 检测试剂盒的设计特点使其成为一种简单但高性能的新型 qPCR 检测方法，兼具特异性和稳健性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Solaris aPCR 基因表达 ROX 预混液（入门装规格）	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/INT	100 × 25 μL 反应
Solaris qPCR 基因表达 ROX 预混液	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/A	200 × 25 μL 反应
Solaris qPCR 基因表达 ROX 预混液	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/B	400 × 25 μL 反应
Solaris qPCR 基因表达 ROX 预混液	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/C	1000 × 25 μL 反应
Solaris qPCR 基因表达检测引物	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AX-XXXXXX-XX-XXXX*	100 次反应 (1 × 125 μL) 200 次反应 (2 × 125 μL) 400 次反应 (4 × 125 μL) 或 1000 次反应 (10 × 125 μL)
Verso cDNA 合成试剂盒	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1453/A AB-1453/B	40 × 20 μL 反应 100 × 20 μL 反应
ABgene 96 孔板（带裙边，低矮型，白色）**	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-0800/W	25 块
ABgene Diamond Ultra 384 孔 PCR 板，白色 **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-2150/W	25 块
Absolute qPCR 粘性封膜	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1170	50 张
* 货号因产品而异。请访问 www.thermo.com/solaris 选择合适的检测引物
** 关于热循环仪兼容性及颜色选项，请参阅最新产品目录或访问 www.thermo.com/pcrplastics