在 Xenopus 卵母细胞中可视化 RNA 定位

摘要

可视化 体内 RNA 运输通过将荧光标记的 RNA 转录本显微注射到 非洲爪蟾 卵母细胞，随后进行共聚焦显微镜观察。

摘要

RNA定位是建立细胞极性的一种保守机制。Vg1 mRNA定位于卵母细胞的植物极。 非洲爪蟾 卵母细胞，并在空间上限制Vg1蛋白的基因表达。通过这种方式对Vg1分布进行严格调控，是胚胎发育过程中正确形成胚层所必需的。Vg1 mRNA的3'非翻译区（3' UTR）中的RNA序列元件，即Vg1定位元件（Vg1 localization element, VLE），足以且必需介导其运输。为研究Vg1 mRNA的识别与运输机制 体内我们开发了一种成像技术，可通过简单的可视化读出，实现对转录因子介导的转运机制的深入分析。

为了观察RNA的定位，我们合成了荧光标记的VLE RNA，并将该转录本显微注射到单个卵母细胞中。注射后，将卵母细胞进行培养，以允许注入的RNA发生转运，随后固定并脱水，再通过共聚焦显微镜成像。mRNA定位模式的可视化可作为监测RNA运输全过程的读出指标，同时可用于鉴定转录本内部顺式作用元件以及结合VLE的反式作用因子在指导RNA运输中的功能（Lewis等，2008；Messitt等，2008）。我们已将该技术进一步拓展，用于与其他RNA和蛋白质的共定位分析（Gagnon和Mowry，2009；Messitt等，2008），并结合运动蛋白和细胞骨架的干扰实验（Messitt等，2008），以探究mRNA定位背后的分子机制。

方案

第1部分：荧光标记mRNA的转录。

1. 将含有RNA定位元件或其他相关序列的质粒DNA线性化，并重悬于 1 μg/μl 使用经DEPC处理的H₂O. DNA 模板必须含有上游的 T7、SP6 或 T3 RNA 聚合酶启动子位点，以启动转录。
2. 向无菌的 1.5 mL 离心管中加入以下试剂：

   a. 10X Tx 缓冲液（见 M&M)	2 μl
   b. 20倍浓度帽/核苷三磷酸混合液（参见M&M)	1 μl
   c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP（Invitrogen）	1 μl
   d. UTP，[α-32P](1 μCi/μl（Perkin Elmer）	1 μl
   e. DEPC-H2O	11 μl
   f. 0.2 M DTT	1 μl
   g. RNasin（Promega）	1 μl
   线性模板DNA	1 μl
   i. RNA聚合酶（Promega）	1 μl

3. 轻柔混匀试剂，并短暂离心（微型离心机中离心10秒）。
4. 孵育2-4小时，温度为 37° C用铝箔覆盖试管，以防止荧光染料发生光漂白。
5. 添加 1 μl 1 mg/ml 无RNase的DNase（Promega），用于降解模板DNA。
6. 37 °C孵育15分钟 37° C.
7. 添加 79 μl 20 mM EDTA（pH 8.0）终止反应。
8. 移除 1 μl 转移到另一支已标记为“input”的离心管中并保存。
9. 通过1 ml G50柱离心反应物（参见材料） & 方法），可保留未掺入的核苷酸，同时去除全长 mRNA。
10. 通过乙醇沉淀法浓缩RNA：
    1. 添加 250 μl 100% 乙醇 10 μl 7M CH₃COONH₄, 1 μl 载体RNA（酵母tRNA， 10 μg/μl）或 1 μl 糖原（20 mg/ml）
    2. 充分混匀后，在 -80° C 用于 >30 分钟，或置于干冰中 15 分钟。
    3. 在微量离心机中以最大速度离心15分钟，倾去上清液。
    4. 用……洗涤 150 μl 75% 乙醇
    5. 在微量离心机中以最大速度离心3分钟，弃去上清液。
    6. 干燥沉淀物 37° C 3 分钟，确保所有乙醇完全挥发。
11. 重悬于 11 μl DEPC-H₂O 并移除 1 μl 转移到另一支标记为“incorporated”的离心管中。
12. 确定掺入率，并将RNA稀释至50 nM（参见材料） & 计算方法）。
13. RNA 应在 5 μl 分装成单次使用量，以避免冻融循环，并可在 -20 °C 下保存数周80° C.

第2部分：显微注射的准备工作。

1. RNA 制备：
   解冻一份 RNA 样品（50 nM），在 70°C 下变性 3–5 分钟。在室温下使用微型离心机以最大转速离心 10 分钟，以去除任何不溶物，并将样品置于冰上保存。
2. 卵母细胞制备：
   1. 从 Xenopus laevis 雌性个体（Nasco）中手术取出卵巢。
   2. 将 Xenopus laevis 卵巢组织剪碎后放入含有 25 ml 胶原酶溶液的 50 ml 锥形管中（见材料与方法）。
   3. 在 18°C 下轻轻振荡 15 分钟，或直至卵母细胞明显从卵巢组织中分离。由于不同批次胶原酶活性存在差异，消化时间可能有所不同，应通过肉眼观察密切监测，以确保充分去滤泡。
   4. 让卵母细胞在管中自然沉降，吸除上清液，并用 MBSH 缓冲液洗涤卵母细胞（见材料与方法）。
   5. 重复洗涤两次，共洗涤三次。该卵母细胞分离方案与 Cohen 等人（2009）所述方法类似。
   6. 在体视显微镜下，于 MBSH 缓冲液中手动挑选 III 期/IV 期卵母细胞（Dumont, 1972）。III 期卵母细胞完全不透明且呈白色，而 IV 期卵母细胞略大，表面有色素斑点。略微透明的卵母细胞发育过早，而完全着色或色素呈极性分布的卵母细胞则过于成熟。
3. 注射针制备：
   将玻璃毛细管拉制并打磨成外径约 0.05 mm 的注射针。（我们使用 Drummond Scientific 3.5 英寸毛细管（货号 # 3-000-203-G/X）、Sutter Instrument Co. 的微量移液器拉制仪和 WPI Inc. 的磨针仪。）

第3部分：显微注射

1. 使用DEPC-H₂O校准针头，确保每次注射量为2 nl。我们使用气体驱动的显微注射仪（见材料与方法）对针头进行前部加样，并利用千分尺校准液滴大小。
2. 将RNA装入针头中。
3. 将分选好的卵母细胞放入含有MBSH缓冲液的注射皿中。我们通常在铺有一层黑色泡沫橡胶的培养皿中进行显微注射，浅色的卵母细胞在白色背景下清晰可见。
4. 小心地向每个卵母细胞注射2 nl、50 nM的RNA。
5. 排出残留RNA，用DEPC-H₂O冲洗针头，然后加载下一个待注射的RNA样品。

第4部分：卵母细胞培养

1. 将卵母细胞置于无菌24孔板（Sigma Aldrich）的一个孔中。每个孔最多可培养一千个卵母细胞。
2. 吸除缓冲液，每孔加入400 μl Oocyte Culture Medium（OCM；见材料与方法）。将培养板放入密闭的塑料容器中，并在容器内放置湿润的纸巾以维持培养期间的湿润环境。
3. 在18°C下孵育卵母细胞，孵育时间范围为8至48小时。

第5部分：卵母细胞的固定、脱水与保存

1. 挑出任何已死亡的卵母细胞，并将存活的卵母细胞置于玻璃小瓶中。我们常规观察 >90% 存活率
2. 将卵母细胞置于 MEMFA 固定液中（参见材料） & 方法）并在岩石上孵育20分钟。用铝箔覆盖以避光保护卵母细胞。
3. 用等体积的 MBSH 缓冲液去除固定剂，洗涤卵母细胞。重复此洗涤步骤一次，共洗涤两次。
4. 将卵母细胞洗涤至无水甲醇中：
   1. 移除一半体积，用甲醇补足。
   2. 重复步骤“a”两次。
   3. 移除所有溶液，更换为甲醇。
   4. 重复甲醇洗涤。
5. 卵母细胞可在 -20° C 直到准备成像时为止。

第6部分：通过共聚焦显微镜成像RNA定位

1. 成像前，向玻璃底FluoroDish（WPI Inc.）中加入Murray透明介质（2:1的苯甲酸苄酯-苯甲醇），以覆盖成像表面。
2. 小心将卵母细胞从甲醇转移至FluoroDish中，尽量减少所带入的甲醇体积。
3. 在倒置共聚焦显微镜上进行成像（我们已成功使用Zeiss LSM510和Leica TCS SP2）。

图1：通过显微注射荧光标记转录本实现亚细胞RNA定位的可视化。A. 显微注射后，用Alexa Fluor 546标记的RNA最初局限于细胞核内。B. 培养8小时后，可见荧光标记的对照RNA均匀分布于卵母细胞的细胞质中。C. 然而，含有可招募转运机制序列的荧光标记RNA可见正在向卵母细胞的植物极（下方）进行亚细胞定位。比例尺 = 50 μm。

讨论

本文介绍了一种用于可视化mRNA定位的实验方案 非洲爪蟾 卵母细胞。该方法使用荧光标记的RNA转录本，相较于以往使用的地高辛标记转录本具有更高的信噪比，且比基于原位杂交的方法更简便、快速（Mowry and Melton, 1992; Gautreau et al., 1997）。利用该方法，我们可设计RNA序列突变并快速检测其影响。 体内 功能。此外，通过使用其他Alexa-UTP荧光染料，可在同一个卵母细胞中同时观察多种RNA分子。我们发现，在 非洲爪蟾 卵母细胞中，Alexa Fluor 546-14-UTP 的效果优于 Alexa Fluor 488-5-UTP，原因是 488 nm 波长范围内存在自发荧光；然而，仍可实现两种 RNA 的双色成像（Gagnon and Mowry, 2009）。此外，该技术可与免疫染色方案联合使用，以检测蛋白质的共定位，因为已有多种兼容的荧光二抗可供选择（Yoon and Mowry, 2006, Messitt et al., 2008）。最后，通过过表达显性负性因子或小分子干扰破坏 RNA 定位过程，可与该检测方法结合，用于观察 mRNA...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>10X Tx 缓冲液
60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM 亚精胺-HCl
<强>20x 帽/NTP 混合液
10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G 帽类似物（New England Biolabs）
<强>G-50 柱
水化5 g Sephadex G-50凝胶珠（Sigma Aldrich）于100 ml去离子H2O. 使用DEPC处理30分钟，然后高压灭菌。不完全配制的储存液在室温下保存。使用前，加入以下无RNase的溶液： 0.5 ml 0.2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8.0 0.5 ml 20% SDS 将完整的G-50溶液在4℃保存 ° C. 从一个3 ml注射器（BD Biosciences）中取出并丢弃活塞，将注射器筒体放入一个15 ml锥形管（Corning）中。用少量玻璃棉堵塞注射器底部（堵塞物大小约为硬币的一半）。 轻轻涡旋G-50溶液以重悬珠子。 向空柱中加入2 ml G-50溶液。 以 1,000 x 旋转 1 分钟 g 在台式离心机中。 加入200 μl DEPC 处理的去离子水2向每列加入 O。离心。 重复洗涤两次，共洗涤三次。 将注射器筒移至新的15 ml离心管中。
<强>胶原酶溶液
75 mg 胶原酶来自 Clostridium histolyticum （Sigma Aldrich） 25 ml 0.1 M KPO3+（pH 7.4）
<强>MBSH缓冲液
88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO₃3 0.82 mM MgSO₄4 X 7H2O 0.33 mM Ca(NO₃)₂3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES（pH 7.6）
<强>卵母细胞培养基
50% L15培养基 15 mM HEPES（pH 7.6） 1 mg/ml 胰岛素 100 mg/ml 庆大霉素 50 U/ml 制霉菌素 50 U/ml 青霉素 50 mg/ml 链霉素
<强>MEMFA溶液
0.1 M MOPS（pH 7.4） 2 mM EGTA 1 mM MgSO₄4 3.7% 甲醛
<强>计算RNA产量
测定每分钟计数（CPM） "输入" 和 "整合" 使用标准的闪烁计数器对样品进行检测。 掺入 = ("整合") / (10 × "输入") 典型的掺入值范围在 ~0.03 至 0.10 之间。 不同聚合酶的最大理论产量：T7、T3、SP6 - 2.64 μg 反应产率 μg = （聚合酶的最大产量）×（整合率） 将RNA稀释至50 nM = (μg RNA) / 320 / (RNA 长度，单位为碱基) / (5×10-8) 反应通常产生约 50-100 μ50 nM 的 RNA 量。