在 Xenopus 卵母细胞中可视化 RNA 定位

摘要

可视化 体内 RNA 运输通过将荧光标记的 RNA 转录本显微注射到 非洲爪蟾 卵母细胞，随后进行共聚焦显微镜观察。

摘要

RNA定位是建立细胞极性的一种保守机制。Vg1 mRNA定位于卵母细胞的植物极。 Xenopus laevis 卵母细胞，并在空间上限制Vg1蛋白的基因表达。通过这种方式对Vg1分布进行严格调控，是胚胎发育过程中正确形成胚层所必需的。Vg1 mRNA的3'非翻译区（3' UTR）中的RNA序列元件，即Vg1定位元件（VLE），足以且必需介导其运输。为研究Vg1 mRNA的识别与运输 体内我们开发了一种成像技术，可通过简单的可视化读取实现对转录因子介导的转运机制的深入分析。

为了观察RNA的定位，我们合成了荧光标记的VLE RNA，并将该转录本显微注射到单个卵母细胞中。注射后，将卵母细胞进行培养，以允许注入的RNA发生转运，随后固定并脱水，再通过共聚焦显微镜成像。mRNA定位模式的可视化可作为监测RNA转运完整通路的读出指标，同时可用于鉴定转录本内部顺式作用元件以及结合VLE的反式作用因子在指导RNA转运中的功能（Lewis等，2008；Messitt等，2008）。我们已将该技术进一步拓展，用于与其他RNA和蛋白质的共定位研究（Gagnon和Mowry，2009；Messitt等，2008），并结合运动蛋白和细胞骨架的干扰实验（Messitt等，2008），以探究mRNA定位背后的分子机制。

方案

第一部分：荧光标记mRNA的转录。

1. 将含有RNA定位元件或其他相关序列的质粒DNA线性化，并用DEPC处理的H₂O重悬至1 μg/μl₂O. DNA模板必须含有供T7、SP6或T3 RNA聚合酶进行转录的上游启动子位点。
2. 向无菌的 1.5 mL 离心管中加入以下试剂：

   a. 10X Tx 缓冲液（见 M&M	2 μl
   b. 20倍浓度加帽/NTP混合液（见M&M	1 μl
   c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP（Invitrogen）	1 μl
   d. UTP，[α-32P](1 μCi/μl)（Perkin Elmer）	1 μl
   e. DEPC-H2O	11 μl
   f. 0.2 M DTT	1 μl
   g. RNasin（Promega）	1 μl
   线性模板DNA	1 μl
   i. RNA聚合酶（Promega）

讨论

在此，我们介绍了一种用于可视化mRNA定位的实验方案 非洲爪蟾 卵母细胞。该方法使用荧光标记的RNA转录本，相较于之前使用的地高辛标记转录本具有更高的信噪比，且比基于原位杂交的方法更简便、快速（Mowry and Melton, 1992; Gautreau et al., 1997）。利用该方法，我们可设计RNA序列突变并快速检测其影响。 在体 功能。此外，通过使用其他Alexa-UTP荧光染料，可在同一个卵母细胞中同时观察多种RNA分子。我们发现，在 非洲爪蟾 卵母细胞中，Alexa Fluor 546-14-UTP 的效果优于 Alexa Fluor 488-5-UTP，原因是 488 nm 波长范围内存在自发荧光；然而，仍可实现两种 RNA 的双色成像（Gagnon 和 Mowry，2009）。此外，该技术可与免疫染色方案联合使用，以检测蛋白质共定位，因为已有多种兼容的荧光二抗可供选择（Yoon 和 Mowry，2006；Messitt 等，2008）。最后，可通过过表达显性负性因子或小分子干扰破坏 RNA 定位过程，并将该干预手段与本检测方法结合，以观察 mRNA 定位通路.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10X Tx buffer
60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM spermidine-HCl
20x cap/NTP mix
10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)
G-50 column
Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H2O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions: 0.5 ml 0.2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8.0 0.5 ml 20% SDS Store complete G-50 solution at 4 ° C. Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny). Swirl complete G-50 solution to resuspend beads. Add 2 ml G-50 solution to the empty column. Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge. Add 200 μl DEPC-treated deionized H2O to each column. Spin. Repeat wash twice more for a total of three washes. Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.
Collagenase solution
75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 25 ml 0.1 M KPO3+ (pH 7.4)
MBSH buffer
88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO3 0.82 mM MgSO4 X 7H2O 0.33 mM Ca(NO3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES (pH 7.6)
Oocyte Culture Medium
50% L15 medium 15 mM HEPES (pH 7.6) 1 mg/ml insulin 100 mg/ml gentamicin 50 U/ml nystatin 50 U/ml penicillin 50 mg/ml streptomycin
MEMFA solution
0.1 M MOPS (pH 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde
Computing RNA yield
Determine CPM in "input" and "incorporated" samples using a standard scintillation counter. incorporation = ("incorporated") / (10 x "input") Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10. Maximum theoretical yields for different polymerases: T7, T3, SP6 - 2.64 μg Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation) Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10-8) The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.