在 Xenopus 卵母细胞中可视化 RNA 定位

摘要

可视化 体内 RNA 运输通过将荧光标记的 RNA 转录本显微注射到 非洲爪蟾 卵母细胞，随后进行共聚焦显微镜观察。

摘要

RNA定位是建立细胞极性的一种保守机制。Vg1 mRNA定位于卵母细胞的植物极。 非洲爪蟾 卵母细胞，并在空间上限制Vg1蛋白的基因表达。通过这种方式对Vg1分布进行严格调控，是胚胎发育过程中正确形成胚层所必需的。Vg1 mRNA的3'非翻译区（3' UTR）中的RNA序列元件，即Vg1定位元件（Vg1 localization element, VLE），足以且必需介导其运输。为研究Vg1 mRNA的识别与运输机制 体内我们开发了一种成像技术，可通过简单的可视化读出，实现对转录因子介导的转运机制的深入分析。

为了观察RNA的定位，我们合成了荧光标记的VLE RNA，并将该转录本显微注射到单个卵母细胞中。注射后，将卵母细胞进行培养，以允许注入的RNA发生转运，随后固定并脱水，再通过共聚焦显微镜成像。mRNA定位模式的可视化可作为监测RNA运输全过程的读出指标，同时可用于鉴定转录本内部顺式作用元件以及结合VLE的反式作用因子在指导RNA运输中的功能（Lewis等，2008；Messitt等，2008）。我们已将该技术进一步拓展，用于与其他RNA和蛋白质的共定位分析（Gagnon和Mowry，2009；Messitt等，2008），并结合运动蛋白和细胞骨架的干扰实验（Messitt等，2008），以探究mRNA定位背后的分子机制。

方案

第1部分：荧光标记mRNA的转录。

1. 将含有RNA定位元件或其他相关序列的质粒DNA线性化，并重悬于 1 μg/μl 使用经DEPC处理的H₂O. DNA 模板必须含有上游的 T7、SP6 或 T3 RNA 聚合酶启动子位点，以启动转录。
2. 向无菌的 1.5 mL 离心管中加入以下试剂：

   a. 10X Tx 缓冲液（见 M&M)	2 μl
   b. 20倍浓度帽/核苷三磷酸混合液（参见M&M)	1 μl
   c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP（Invitrogen）	1 μl
   d. UTP，[α-32P](1 μCi/μl（Perkin Elmer）	1 μl
   e. DEPC-H2O	11 μl
   f. 0.2 M DTT	1 μl
   g. RNasin（Promega）	1 μl
   线性模板DNA	1 μl
   i. RNA聚合酶（Prom....

讨论

本文介绍了一种用于可视化mRNA定位的实验方案 非洲爪蟾 卵母细胞。该方法使用荧光标记的RNA转录本，相较于以往使用的地高辛标记转录本具有更高的信噪比，且比基于原位杂交的方法更简便、快速（Mowry and Melton, 1992; Gautreau et al., 1997）。利用该方法，我们可设计RNA序列突变并快速检测其影响。 体内 功能。此外，通过使用其他Alexa-UTP荧光染料，可在同一个卵母细胞中同时观察多种RNA分子。我们发现，在 非洲爪蟾 卵母细胞中，Alexa Fluor 546-14-UTP 的效果优于 Alexa Fluor 488-5-UTP，原因是 488 nm 波长范围内存在自发荧光；然而，仍可实现两种 RNA 的双色成像（Gagnon and Mowry, 2009）。此外，该技术可与免疫染色方案联合使用，以检测蛋白质的共定位，因为已有多种兼容的荧光二抗可供选择（Yoon and Mowry, 2006, Messitt et al., 2008）。最后，通过过表达显性负性因子或小分子干扰破坏 RNA 定位过程，可与该检测方法结合，用于观察 mRNA.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>10X Tx 缓冲液
60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM 亚精胺-HCl
<强>20x 帽/NTP 混合液
10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G 帽类似物（New England Biolabs）
<强>G-50 柱
水化5 g Sephadex G-50凝胶珠（Sigma Aldrich）于100 ml去离子H2O. 使用DEPC处理30分钟，然后高压灭菌。不完全配制的储存液在室温下保存。使用前，加入以下无RNase的溶液： 0.5 ml 0.2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8.0 0.5 ml 20% SDS 将完整的G-50溶液在4℃保存 ° C. 从一个3 ml注射器（BD Biosciences）中取出并丢弃活塞，将注射器筒体放入一个15 ml锥形管（Corning）中。用少量玻璃棉堵塞注射器底部（堵塞物大小约为硬币的一半）。 轻轻涡旋G-50溶液以重悬珠子。 向空柱中加入2 ml G-50溶液。 以 1,000 x 旋转 1 分钟 g 在台式离心机中。 加入200 μl DEPC 处理的去离子水2向每列加入 O。离心。 重复洗涤两次，共洗涤三次。 将注射器筒移至新的15 ml离心管中。
<强>胶原酶溶液
75 mg 胶原酶来自 Clostridium histolyticum （Sigma Aldrich） 25 ml 0.1 M KPO3+（pH 7.4）
<强>MBSH缓冲液
88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO₃3 0.82 mM MgSO₄4 X 7H2O 0.33 mM Ca(NO₃)₂3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES（pH 7.6）
<强>卵母细胞培养基
50% L15培养基 15 mM HEPES（pH 7.6） 1 mg/ml 胰岛素 100 mg/ml 庆大霉素 50 U/ml 制霉菌素 50 U/ml 青霉素 50 mg/ml 链霉素
<强>MEMFA溶液
0.1 M MOPS（pH 7.4） 2 mM EGTA 1 mM MgSO₄4 3.7% 甲醛
<强>计算RNA产量
测定每分钟计数（CPM） "输入" 和 "整合" 使用标准的闪烁计数器对样品进行检测。 掺入 = ("整合") / (10 × "输入") 典型的掺入值范围在 ~0.03 至 0.10 之间。 不同聚合酶的最大理论产量：T7、T3、SP6 - 2.64 μg 反应产率 μg = （聚合酶的最大产量）×（整合率） 将RNA稀释至50 nM = (μg RNA) / 320 / (RNA 长度，单位为碱基) / (5×10-8) 反应通常产生约 50-100 μ50 nM 的 RNA 量。