利用脂质介相结晶膜蛋白以进行结构测定

摘要

本文描述了Caffrey膜结构与功能生物学研究组采用的手动设置膜蛋白在脂质介相中结晶实验的步骤。

摘要

本文介绍了一种利用脂质介相结晶膜蛋白的详细实验方案。该方法也被称为脂质立方相法或in meso法。该方法已被证明具有高度的通用性，已成功用于解析原核和真核蛋白、单体蛋白以及同源与异源多聚体蛋白、含发色团与不含发色团蛋白，以及α-螺旋和β-桶状结构蛋白的X射线晶体结构。近年来采用in meso结晶法取得的重要成果包括人源工程化β2-肾上腺素能受体和腺苷A2a G蛋白偶联受体。本文提供了将膜蛋白重组入单油精基介相的方案，以及手动模式下设置结晶实验的操作流程。整个流程中的其他步骤，例如晶体收获，将在后续的视频文章中进行介绍。手动制备载蛋白介相并完成一块结晶板的设置大约需要一小时。

方案

结构生物学与功能生物学领域的一个重要研究对象是生物膜（图1）。生物膜存在于细胞及细胞内细胞器的周围，是一种分子级薄层结构，厚度仅为两个脂质分子，并镶嵌有多种蛋白质。脂质和蛋白质的结构与功能均是研究关注的重点。然而，本文的重点仅限于膜蛋白。

深入了解膜蛋白在分子水平上的功能机制出于两个原因。首先，了解其作用机制本身具有重要的科学意义。其次，通过了解蛋白质的工作原理，一旦其功能失常，就有可能对其进行修复，或针对特定应用对其进行改进甚至改造。这类研究工作的一个直接应用便是药物设计。在分子水平上阐明膜蛋白功能机制的一种方法是测定其结构，即确定构成该蛋白质的所有原子（或至少所有非氢原子）在三维空间中的位置。我们采用的方法是大分子X射线晶体学（MX）。图2展示了一个通过MX方法测定结构的膜蛋白实例。进行MX研究需要获得具有衍射质量的蛋白质晶体。

显然，使用大分子晶体学进行结构测定涉及多个步骤，如图3所示。这些步骤通常包括确定膜蛋白靶标，随后对其进行表达、纯化和结晶。利用实验室X射线源或同步辐射X射线源对晶体进行衍射测量。对衍射数据进行处理，得到电子密度图，并将其与分子模型进行拟合。经过优化的模型可用于研究蛋白质的作用机制以及基于结构的药物设计。

本文的重点是展示如何利用脂质介相（lipidic mesophases）通过所谓的 在中间相中 方法。关于该方法及其应用范围的最新综述见参考文献1（Caffrey, 2009）。本实验所遵循的逐步操作方案详见参考文献2（Caffrey和Cherezov, 2009）。

图4展示了建立膜蛋白in meso结晶实验所需步骤及时间的流程图。本文涵盖由红色虚线框出的步骤。

第1部分：结晶板的制备

1. 将一块硅化显微镜载玻片放置在工作台上。
2. 从一段带穿孔的双面胶间隔胶带（可商业购得，参见下文“特定试剂与设备表”）的一侧揭去保护纸。
3. 将胶带粘性面向下，贴附在载玻片表面。
4. 使用压辊或滚轮对胶带与载玻片进行加压密封。可在胶带与滚轮之间放置铝箔以保护孔底。
5. 揭去胶带另一侧的第二层保护纸，暴露出上表面的粘性区域。
6. 将单个硅化盖玻片放置在靠近板位的位置，以便在加样完成后快速高效地完成孔的封合。

第2部分：准备脂质注射器

1. 将脂质（通常为单油精）置于45 °C的温控金属块中加热3分钟，使其熔化。
2. 在脂质熔化的同时，准备两支100-μL耐压气密式Hamilton注射器，用于后续的脂质-蛋白混合步骤。取下将要盛装蛋白溶液的注射器中的聚四氟乙烯（Teflon）垫圈。将用于盛装脂质的注射器并排放置（保留其垫圈）。
3. 将连接器（参见下方“试剂与设备清单”及参考文献3（Cheng et al., 1998））连接至脂质注射器。用手拧紧连接器与注射器，但切勿过度拧紧。将脂质注射器的推杆从针筒中取出。
4. 注意：必须在脂质完全熔化后方可继续操作。将移液器调至30 μL，缓慢吸取约30 μL熔融脂质。然后缓慢将尽可能多的熔融脂质注入注射器的开口端，注意避免引入气泡。
5. 将推杆插入针筒，使其接触熔融脂质，并将注射器垂直持握，如视频所示，缓慢推动推杆沿针筒向上移动。在此过程中，可能意外夹带的气泡应会逐渐上浮并排出。
6. 通过观察注射器针筒上的刻度，仔细确定注射器中脂质的体积。
7. 将垫圈套在从连接器伸出的针头上。使用推杆推动熔融脂质沿针筒上升，并缓慢轻柔地压入连接器中心的针头内。

第3部分：准备蛋白注射器

1. 在设置结晶实验之前，应将蛋白质溶液在 4 °C 条件下以 14,000 g 离心 5 至 10 分钟，以去除大分子聚集体。从冰上取出蛋白质溶液，并使其在室温下平衡。
2. 计算用于形成立方相的蛋白质溶液体积，使其达到或接近完全水合状态。对于 20 °C 下的单油酸甘油酯，如相图⁵（图 5）所示，水完全水合时的含水量接近 40 %（质量比）。
3. 使用 25 或 50 μL Hamilton 注射器吸取所需体积的蛋白质溶液。将溶液转移至蛋白质注射器筒内柱塞的聚四氟乙烯（Teflon）尖端，注意避免产生气泡。
4. 小心回抽针头，并测量注射器内蛋白质溶液的体积，应与前一步骤中加入的体积一致。
5. 缓慢推动蛋白质溶液沿筒壁向上移动，使其末端与筒体开口端齐平。
6. 将蛋白质注射器旋入连接于脂质注射器的接头开口端。此步骤中切勿过度拧紧装置。若在此阶段过度拧紧混合装置，会损坏卡套并导致泄漏；拧紧不足也会引起泄漏。

第4部分：混合蛋白质溶液与脂质：制备中间相

1. 为实现混合，用拇指或食指推动组装好的混合装置中蛋白侧的推杆至极限位置，使蛋白溶液从蛋白注射器中排出，经过连接器进入脂质注射器。
2. 随后使用脂质侧的推杆，将脂质注射器中的内容物通过连接器推回蛋白注射器中。
3. 此过程需重复多次；有时需要进行一百次以上的往复操作才能形成均匀的中间相。在混合初期，物料通过连接器的往复运动可能不均匀，有时需要施加额外的力以促进混合。初始混合阶段通常伴随样品中出现不均匀的浑浊现象。随着均质化的进行，样品质地逐渐变得均匀，并呈现出黏稠立方相特有的外观特征，即形成典型的立方中间相。
4. 若条件适宜且形成了立方相，分散体系在注射器筒内应呈现光学透明状态。因此，应能清晰地透过筒内的中间相读取注射器筒壁上的刻度标记。
5. 在混合过程中，将注射器混合装置短暂置于冰上进行轻微冷却，可加速均质化并促进透明性的获得。但需注意避免过度冷却样品。
6. 应避免过于剧烈的混合操作，因为这可能导致因摩擦生热而引起样品温度升高³。

第5部分：装载分配器

1. 从10-μL Hamilton注射器上取下针头和推杆。保留聚四氟乙烯（Teflon）卡环在原位。
2. 使用小硬币辅助，从分配器上取下固定螺母。
3. 将棘轮臂完全缩回，然后将注射器（不带推杆和针头）穿过分配器的固定环。
4. 将固定螺母重新装上，垫圈面朝向注射器，并将其拧紧在注射器的开口端。
   应注意确保注射器在固定环中居中，且筒体与棘轮臂平行。这两点可通过目测判断。满足这两个条件对防止泄漏至关重要。
5. 将推杆穿过夹持环（夹紧螺母先松开几圈），引导推杆进入注射器的开口端。将棘轮臂完全压下。推动推杆进入筒体，检查其在筒体内是否能自由且直线移动。可适当松开导杆上的螺丝以帮助推杆顺畅移动。务必确保推杆移动自如。将推杆压下，直至其聚四氟乙烯（Teflon）尖端与筒体上的0 μL刻度线对齐。如果导杆上的螺丝曾被松开，请重新拧紧并再次检查推杆是否仍能自由移动。
6. 将组装好的混合单元一侧的推杆移至0 μL刻度线，以将中间相转移至另一支注射器和连接器中。
7. 将空注射器（保留其卡环）从混合单元上断开，并立即把已装样且连接有连接器的注射器接到10-μL分配注射器的螺纹端。连接时的紧固程度至关重要，如前所述。
8. 通过按压100-μL注射器的推杆，使中间相经由连接器转移，从而完成分配注射器的装样。
9. 将一根短的平头针头固定在分配注射器的钢制末端，并小心拧紧。
10. 通过拧紧夹持环中的螺母，将推杆固定在棘轮臂上。应注意不要过度拧紧螺母，否则可能划伤或变形推杆，导致其无法使用。在夹紧状态下，棘轮臂的行程范围应限制在不超过一英寸，如视频中所示。超过此范围，推杆容易发生弯曲，导致给液失败。
11. 多次按压棘轮鼓轮，使推杆在筒体内前进，从而填满针头的空体积并完成针头装样。此步骤应重复（最多十次），直至有连续的中间相液丝从针头尖端流出。
12. 应立即开始结晶试验，因为某些蛋白质在无添加沉淀剂的立方相中不稳定。

第6部分：设置结晶板

1. 将多孔结晶板和盖玻片放置在高于工作台几英寸的平面上，以便于加样。当表面略呈深色时，可获得最佳对比度和增强的可见性。
2. 混匀沉淀剂溶液并打开瓶盖。将分配移液器设定为 1 μL。
3. 一手垂直持握分配用注射器，另一手将针尖置于第1号孔底部正上方中央位置。按下重复分配器上的按钮，将一段200 nL的中间相（mesophase）释放到玻璃表面（使用标准重复分配器配合10 μL注射器时）。针尖距孔底不得超过数百微米，以确保准确递送。
4. 在相邻的4个孔中完成中间相加样后，使用2 μL移液器和标准一次性吸头，在每个中间相液滴上方加入1 μL沉淀剂溶液。
5. 尽快将盖玻片准确地覆盖在已加样孔上，确保均匀密封。为实现防水密封，使用刮刀对盖玻片与间隔胶带暴露粘性表面接触的区域施加压力。
6. 可重复进行中间相和沉淀剂的分配过程，直至板上所有孔均完成加样并密封。
7. 清晰标记板以用于追踪。对光敏感的蛋白质通常在放入孵育室前用铝箔包裹板体。
8. 将板置于温度可控的孵育室中，通常设为 20 °C。
9. 按照固定时间表，使用配备10倍或20倍物镜的偏光显微镜定期检查孔内晶体生长情况。作者实验室采用的时间表如下：设置后的第0、1、2、3、5、7、14、21、30和60天。仔细检查中间相液滴，在0.14 mm厚的样品内调节焦深。观察应在普通光和交叉偏振光下分别进行。

第7部分：代表性结果

所得晶体的外观会因膜蛋白本身的颜色、观察时光源的偏振状态（或无偏振）以及照明方式和照明质量的不同而有所差异。图6展示了多种可能的晶体外观。in meso 条件下生长的天然有色膜蛋白在普通光下观察时，可能呈现如图6（b和d面板）所示的形态。在立方相中生长且在普通光下观察的无色膜蛋白晶体，可能呈现如图6（e面板）所示的形态。最后，在in meso 条件下生长且在偏振光下观察的无色膜蛋白晶体，可能呈现如图6（a和c面板）所示的形态。

结构解析整体流程的后续步骤包括收集晶体并进行低温冷冻，以及记录和分析晶体的X射线衍射数据。这些主题将在其他 JoVE 文章中分别介绍。

图 1. 生物膜的示意图，显示嵌入其中并分布于其上的脂质双分子层及多种蛋白质。

图 2. 本 JoVE 文章中所介绍的采用 in meso 方法生长晶体并利用 MX 解析出的维生素 B₁₂ 转运蛋白 BtuB 的结构⁶。

图 3. 结构-功能循环展示了获取和利用蛋白质完整结构信息所涉及的多个步骤。

图4. 该流程图总结了通过in meso方法生产膜蛋白晶体所涉及的步骤。本JoVE文章仅涵盖由红色虚线框出的步骤。引自参考文献2。

图 5. 脂质（单油酸甘油酯）/水体系的简化温度-组成相图。结晶实验在 20 °C 下进行，此时脂质在 40% 水合度下达到水饱和。详细相图见参考文献 5。

图6. 膜蛋白在脂质介相中生长的晶体。
(a) 维生素B₁₂转运蛋白BtuB⁶，(b) 光捕获复合物II⁷，(c) 黏附/侵袭蛋白OpcA⁸，(d) 细菌视紫红质⁹，(e) 来自假单胞菌的一种糖转运蛋白。图像采用普通光（b,d,e）和交叉偏振光（a,c）拍摄。

讨论

立方相是一种精细且动态的环境，其状态会随着多个变量的改变而发生显著变化。in meso 结晶试验的手动操作设置无法涵盖所有可能遇到的问题。然而，在将该技术应用于昂贵的蛋白质溶液之前，通过练习掌握操作技巧，并在混合过程中适度控制注射器施加的压力，可避免许多困难。若操作得当，in meso 方法能够获得多种蛋白质的晶体，且成功结晶的蛋白质种类正在持续增加。

此处所述的in meso结晶实验设置主要针对手动操作模式。在需要大规模筛选结晶条件的情况下，该过程可以（也常常）进行调整，以实现结晶板的自动化设置。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白质溶液	试剂	多种	多种
脂质（单油酸甘油酯）	试剂	Sigma-Aldrich	多种
沉淀剂溶液	试剂	多种	多种
纯化水	试剂	EMD Millipore
移液设备	工具	Pipetman	多种
一次性移液器吸头	耗材	Pipetman	多种
气密式注射器	工具	Hamilton Co	80265 (25-µl)
注射器针头	工具	Hamilton Co	7770-020 (规格 22)
窄孔连接器*	工具	Hamilton Co	多种/EBS-LCP-2
重复分配器	工具	Hamilton Co	83700
硅化玻璃显微镜载玻片	耗材	Gold Seal	3010
显微镜盖玻片	耗材	Fisher Scientific	12-548C
带孔双面胶间隔胶带	耗材	Saunders Corporation (已打孔)	NA
镊子	工具	多种	NA
压片辊（滚轮）	工具	Fisher Scientific	50820937
碎冰	温度控制	N/A	NA
纸巾	耗材	N/A	NA
计算器	工具	多种	NA
实验记录本	工具	多种	NA
* 自行加工窄孔连接器的完整细节见参考文献3。