本实验方案描述了从成年斑马鱼中识别和解剖器官的步骤。
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摘要
摘要
在过去的20年中，斑马鱼已成为研究脊椎动物发育与疾病的重要模式生物。尽管对胚胎和幼鱼的实验分析已十分广泛，形态学特征也已有详尽记录，但关于成年斑马鱼解剖结构的系统描述、成体器官和结构的发育研究，以及成鱼操作技术仍较为缺乏。在从幼鱼到成鱼的转变过程中，幼体器官在整体结构、形态及解剖位置上均发生显著变化。体表上，透明的幼鱼逐渐形成具有特征性的成体条纹色素模式和成对的腹鳍；在体内，各器官经历大规模的生长与重塑。此外，具有双向潜能的性腺原基将分化为睾丸或卵巢。本实验方案详细识别了多种成年斑马鱼的器官，并展示了成鱼脑、性腺、消化系统、心脏和肾脏的解剖方法。所获取的组织可用于原位杂交、免疫组织化学、组织学分析、RNA提取、蛋白质分析及其他分子生物学技术。本方案将有助于拓展斑马鱼相关研究，涵盖幼体器官的重塑、成体特有器官的形态发生，以及其他成体器官系统的深入探究。
关键词：斑马鱼，成体解剖，器官发育，性腺分化，消化系统，心脏，肾脏，脑，组织解剖，原位杂交，免疫组织化学，组织学，RNA提取，蛋白质分析
方案
- 首先解剖一条雄性斑马鱼，然后解剖一条雌性斑马鱼。开始解剖前，先将鱼置于0.2% Tricaine中麻醉，再通过在冰水中孵育15分钟实施安乐死。
- 首先用纸巾轻轻拍干鱼体表面，然后将其置于解剖垫上。从外部形态看，斑马鱼具有单个的背鳍、尾鳍和臀鳍，以及成对的胸鳍和腹鳍（图1）。
图1. 成年雄性鱼，鳍已标记。 - 用大头针穿过鱼尾的肉质部分和眼窝的腹侧部分，将其固定在解剖垫上。
- 在鱼腹部肛门鳍前方剪开皮肤。从肛门鳍沿腹部至鳃盖（覆盖鳃部的硬质结构）剪开皮肤及下方肌肉（图2，步骤1）。
图2. 去除皮肤和体壁肌肉以暴露内脏器官的步骤 - 接下来，移除鳃盖和胸鳍，包括胸鳍基部的胸带（鳍基部厚而骨质的区域）（图2，步骤2）。从暴露的鳃后方开始，沿鱼体侧面切开皮肤及下方肌肉，一直延伸至肛鳍（图2，步骤3）。
- 小心地去除鱼体侧面的皮肤及下方的肌肉组织。许多内部器官此时已清晰可见（图3）。
图3. 去除体壁和肌肉后的成年雄性鱼类，以显示其内部器官。 - 睾丸是成对的长条形白色器官，附着于体壁背侧。取一个睾丸置于 PBS 培养皿中。使用反射光观察睾游戏副本，可见其中的曲细精管（图4），曲细精管内含有处于不同发育阶段的生精细胞囊，从精原细胞到精子细胞（Leal 等，2009）。
图4. 睾丸解剖。白色圆形结构为曲细精管。 - 接下来，将鱼体腔内的消化系统取出。肝脏可通过其较大的体积、分叶状形态、棕褐色颜色以及丰富的血管分布来识别。在内脏中还可观察到胆囊，即一个充满绿色透明液体的囊状结构，以及呈鲜红色的脾脏。
- 将肠道与其他器官分离并拉直。根据上皮皱襞的高度，可将肠道分为前肠、中肠和后肠区域（Wallace et al., 2005）。
- 将一段肠道置于磷酸盐缓冲液中，利用透射光观察上皮皱襞。
- 接下来，观察鱼鳔。鱼鳔由后室和前室组成，其中后室通过气 duct 与食管相连，前室则通过韦伯氏器与内耳相连（Finney et al., 2006）。
- 移除并丢弃鱼鳔。取下固定针，将鱼重新以腹面朝上固定，以解剖位于背侧体壁的肾脏。肾脏为淡粉色半透明结构，与背主动脉及色素细胞相关联。肾脏可分为头区、体区和尾区三部分（图5）。切取一部分肾脏组织置于磷酸盐缓冲液（PBS）中，分离肾脏组织以暴露肾小管。
图5. 头部、体部和尾部肾脏沿背侧体壁的位置。 - 解剖一条雌性鱼。如前所述，将鱼置于冰水中实施安乐死后，用纸巾擦干鱼体，再将其固定于解剖垫上。按之前示范的方法去除鱼体一侧的皮肤。卵巢为双叶状结构，由富含血管的卵巢系膜悬吊于体腔内。
- 取出一侧卵巢，置于 PBS 中，用透射光观察。可用细针将卵母细胞分离后进行分期（图6，Selman 等，1993）。I 期卵母细胞大小约为 10 - 150 微米，呈半透明状。II 期卵母细胞大小约为 150 - 350 微米，其特征为出现皮质颗粒。III 期卵母细胞大小为 350 - 750 微米，由于卵黄积累而呈不透明状。成熟的 IV 期和 V 期卵母细胞呈半透明，通常不在近期交配过的雌性个体卵巢中发现。
图6. 在解剖显微镜下利用透射光观察到的处于 I、II 和 III 期的活体卵母细胞。 - 接下来，从鱼体内解剖出心脏。心脏位于鳃的后方和腹侧。首先将心脏及其周围所有组织一并剪下，并置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。随后仔细剥离心脏周围的组织，注意不要损伤 delicate 的心房。
- 将解剖后的心脏置于林格氏液中，以观察心脏搏动。
识别心房、心室和动脉球（图7，Hu等，2001）。
图7. 解剖的成年心脏。 - 通过将鱼脑从鱼体中取出以完成解剖。首先解除固定鱼体的图钉，用剃刀片切下鱼头。用镊子尽可能去除颅骨腹侧的软组织。使用小型弹簧剪剪除眼睛。打开颅骨，去除脑腹侧的骨组织。随后将鱼头置于盛有PBS的培养皿中，从脑背侧去除皮肤和颅骨骨片。
- 识别嗅球、端脑、缰核、视顶盖、小脑和延髓（图8，Wullimann等，1996；Schilling，2002）。
图8. 成年斑马鱼解剖脑组织。背侧观，上端为头侧。
披露
动物实验严格按照宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会制定的指南和规定进行。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01 HD050901（授予MCM）以及美国癌症协会博士后奖学金#PF-05-041-01-DDC（授予TG）支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂： | |||
| 0.2% 三卡因（Tricaine，乙基-3-氨基苯甲酸酯） 200 mg 三卡因粉末 97.9 ml 去离子水 ~1 ml 1 M Tris（pH 9） 调节pH至7.0 | |||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） 4.0 g NaCl 0.1 g KCl 100 ml 0.1 M 磷酸盐缓冲液4 缓冲液，pH 7.3 150 ml dH₂O2O | |||
| 林格氏液’s 溶液 6.7g NaCl 0.2 g KCl 0.2 g CaCl2 1.2 g Hepes 1 L H2O 调节pH至7.2 | |||
| 带垫片的解剖皿 | Electron Microscopy Sciences | 70540 | |
| 万纳斯弹簧剪 | 精细科学工具 | 91500-09 |
参考文献
- Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio). J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).
- Hu, N., Yost, H. J., Clark, E. B. Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish. Anat Rec. 264, 1-12 (2001).
- Leal, M. C., Cardoso, E. R., Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., França, L. R., Schulz, R. W. Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations. Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).
- Schilling, T. F. The morphology of larval and adult zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series). Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Selman, K., Wallace, R., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the Zebrafish, Brachydanio rerio. J. Morphol. 218, 203-224 (1993).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech Dev. 122, 157-173 (2005).
- Wullimann, M. F., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. , Birkhäuser Verlag. (1996).
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