微观世界的窗口：用于研究多孔介质中微生物迁移的简单微流控系统

摘要

微流控装置可用于实时观察复杂自然过程，并在适当的物理尺度上进行可视化。我们开发了一种简单的微流控装置，可模拟天然多孔介质的关键特征，用于研究地下环境中细菌的生长与迁移。

摘要

微生物在多孔介质中的生长与迁移对地下水和地表水质量、环境中营养物质的循环，以及病原体向饮用水系统的传播具有重要意义。天然多孔介质具有复杂的物理拓扑结构、多样的表面化学性质、动态变化的营养物质与电子受体梯度，以及微生物的斑块状分布。这些特征在微米尺度上存在显著变化，使得宏观尺度下对微生物迁移的研究结果难以解释，也使机理模型的验证变得困难。在此，我们展示了如何利用简单的微流控装置可视化微生物与微结构生境之间的相互作用，识别影响观测现象的关键过程，并系统性地验证预测模型。这些简单易用的流动池由透明、生物相容且透氧的材料聚二甲基硅氧烷（poly(dimethyl siloxane)）制成。采用标准的光刻技术制备微结构母模，并通过复制模塑法将母模用于浇铸微结构流动池。流动池腔室的物理设计可根据实验需求进行调整：微通道可从简单的线性连接到复杂拓扑结构，其特征尺寸最小可达2 μm。我们模块化的EcoChip流动细胞阵列包含数十个相同的腔室，并通过重力驱动的流控模块实现流量调控。我们证明，利用EcoChip装置，可在系统研究表面化学、流体性质或微生物种群特性影响的同时，保持或系统性地调控物理结构和压力水头。通过使用非致病性、表达绿色荧光蛋白的Vibrio细菌菌株，我们阐述了生境结构、流动条件和接种量对基本传质现象的重要性，并通过实时的颗粒尺度观测，证明了微流控技术为观察这一隐秘世界提供了强有力的视角。

方案

一、微流控装置的制备

1. 创建微流控装置的第一步是在计算机辅助设计（CAD）软件中绘制装置的二维布局。我们曾使用 AutoCAD，但也可使用其他绘图软件，例如 CleWin 或 CorelDraw。
2. 下一步是制作光刻掩模。根据装置的尺寸、所需分辨率和预算，这些掩模可采用铬膜制作（分辨率最高，成本较高），也可在照相底片上生成，甚至可通过高分辨率打印机直接打印在透明投影胶片上。本实验中，我们使用了由马萨诸塞州北安多弗市 Advance Reproductions Corp. 制造的 Cr 掩模。
3. 下一步是将掩模上的图案转移到光敏环氧树脂上，以形成具有凸起浮雕结构的模具。
   1. 首先，将负性 SU8 光刻胶以期望的厚度旋涂在硅晶圆表面，并进行烘焙以挥发多余的溶剂。光刻胶的配方和旋转速度决定了成膜厚度。
   2. 随后，通过掩模将图案暴露于预设剂量的紫外光下。曝光后烘焙可使光刻胶涂层中受光照区域发生交联，从而变得不溶于显影液。
   3. 接下来是显影步骤，使用化学显影液去除未曝光的光刻胶，留下一个正向凸起浮雕结构，称为“母模”（master）。
   4. 可选地进行第三次烘焙，即“硬烤”，以进一步固化结构。
4. PDMS 模塑
   1. 我们采用硅基弹性体聚二甲基硅氧烷（poly(dimethyl siloxane)）进行微流控装置的复制模塑¹。首先，将基础材料与固化剂按 10:1 的质量比混合，倒入浅容器（如培养皿）中的模具上，并在真空下脱气，直至所有可见气泡消失。
   2. 然后将含有未固化 PDMS 的母模置于已精确调平的烘箱中，在 65°C 下至少加热 4 小时，以实现聚合物的交联。
   3. PDMS 固化后，将成型部分从培养皿中切割下来，并在装置顶部打孔，以便在最终装置中通入微流道。
5. 与玻璃的键合
   1. 通过氧等离子体处理，可将洁净的 PDMS 与洁净的玻璃进行不可逆键合。首先，将已成型并打孔的 PDMS 和洁净的玻璃载片分别放置于等离子清洗仪中，键合面朝上。我们使用的是 PDC-32G Harrick 等离子清洗仪。
   2. 关闭腔室后，操作者启动真空泵，然后开启射频（rf）源。等离子体将在腔室内自燃，表现为腔内出现微弱的紫色辉光。
   3. 经过 30 秒的等离子体处理后，关闭射频源，随后关闭真空泵。
   4. 迅速将玻璃载片和 PDMS 装置从腔室中取出，并使其直接接触（将成型的 PDMS 面朝下贴合）。这将形成不可逆的键合，同时使表面性质变为亲水性。
   5. 如有需要，可通过表面吸附或共价键合固定蛋白质等方式，在 PDMS 上实现不同的表面化学性质。
   6. 随后，可通过毛细作用力或使用注射器施加轻微压力，使去离子水、培养基或人工地下水等流体填充装置。

II. 基于重量分析法的微流控装置流量定量

1. 为校准装置中的压力驱动流，首先将微结构化流动池预充满去离子水。
2. 将装有液体的储液装置（例如塑料注射器或流动模块，如图1所示）连接至上游入口井，并保持储液装置中的液面高度高于下游井的位置。
3. 在废液井处定期收集样品，并用分析天平称重。
4. 绘制总体积与总时间关系曲线的斜率，即可得到平均体积流量（如图2所示）。我们发现，在广泛的压头范围以及不同的压力维持系统下，平均流速均具有良好的可重复性和线性。

III. 流动可视化、速度映射及亲水/疏水相互作用

1. 用于模型校准的 3 μm 荧光乳胶微球（包括 Carboxy YG 和 Plain YG 表面）购自 Polysciences, Inc.，并用去离子水稀释至 0.01% 固含量。
2. 通过配备 Mightex BCE-B013-U 单色相机的蔡司 Axiovert 25 荧光显微镜观察微球在生境中的流动情况。
3. 以 ImageJ 软件包连续快速采集单帧图像，并将其合成为视频（图 3）。

IV. 用于模拟细菌生长与运输的微流控装置（EcoChip）

1. Vibrio sp. GFP Kan，一种非致病性、表达绿色荧光蛋白的微生物，在LB（Luria-Bertani）培养基中培养约14小时，浓度达到约10⁹ 个细胞/ml。
2. 将生长培养基中的细菌接种至EcoChip装置中，使其在装置内定植，并在19小时内过夜形成菌落聚集体和生物膜。
3. 随后从孔中移除生长培养基，并用人工海水冲洗所有生境（ASW配方详见Wang等人的研究²），使不同生境中保留不同密度的细菌。
4. 其中一个生境保持密封、无流动状态，其余三个生境则维持缓慢流动条件。
5. 在数天时间内，每隔15至20小时拍摄一次细菌生长的荧光与白光图像（图4）。

V. 代表性结果

流控模块为调节和分配多个生境中的流体流动提供了简单的方法。重量分析法被证明是一种简便直接的方法，可用于确定流经生境结构的流速，该流速取决于生境的水力阻力以及进出口孔之间的压力差。在微珠流动实验中，我们观察到未羧基化的微珠在装置表面的聚集程度明显更高（图2）。此外，直径较大的微珠（6 mm和10 mm）更容易被截留在较小的孔隙开口中，并开始在装置内积聚。较高的流速可减少颗粒的滞留和截留。

在细菌生长实验中，流动条件的影响十分明显。持续的剪切力导致细菌聚集在一起形成絮状物，而不会以单个细胞的形式存在。大型细菌絮状物的迁移是一个重要的环境过程，但在宏观系统中极难研究。

图1. 流动模块的结构特征与工作原理示意图。

图2. 通过不同柱高度的重量分析法测定结构化生境中的流速。柱高度比：60 / 40 = 1.5，测得流速比：1.04 / 0.71 = 1.46。当 H = 40 mm 时，所得流速为 V = 0.71 μL/min；当 H = 60 mm 时，V = 1.04 μL/min。对应的估算平均线性流速分别为 3.1 mm/s 和 4.6 mm/s。

图 3. 3 μm 乳胶微球在流经结构化生境时，有羧化与无羧化条件下的运输情况。

图4. 在缓慢流动条件下，细菌生长和生物膜形成随接种密度变化的情况。

讨论

EcoChip 系统可根据具体实验需求进行调整。新的母模相对容易制备，一旦母模制作完成，便可按需浇铸出多个完全相同的复制品。流动模块操作简便，无需特殊设备或复杂的连接装置，可被建模为一个简单的落差压力驱动流动系统。本研究的进一步拓展工作正在进行中，包括构建腐殖酸包覆的微通道，以及系统性地改变流体的水相化学性质。通过该方法，可直接观察并系统研究细菌与表面的微观相互作用，以及多孔介质中的微生物生长与迁移现象。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PDMS	道康宁公司
SU8-2025	MicroChem 公司
荧光微球	Polysciences 公司