视动反应已被广泛用于评估幼体斑马鱼的视觉功能。然而，目前尚无适用于成年斑马鱼的标准实验方案1-5。本文中，我们介绍一种在本实验室建立的新方案，用于测量成年斑马鱼的视动反应（OKR）。
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本文内容
摘要
摘要
视动反应（OKR）是一种动物通过眼球振动来追随周围旋转光栅的行为。该方法已被广泛用于评估幼年斑马鱼的视觉功能1-5。然而，目前尚无适用于成年斑马鱼的标准实验方案。本文介绍了一种在实验室建立的新方案，并利用自行设计的简易装置来测量成年斑马鱼的OKR。本视频将展示该装置的结构以及成年斑马鱼OKR检测的详细操作步骤。此外，视频中还演示了幼年斑马鱼OKR的测量，以及成年斑马鱼视动反应（OMR）测试的过程。本实验中成年斑马鱼OKR检测可持续长达4小时。在对成年斑马鱼视觉系统进行干预的情况下，应用此类成年鱼OKR检测将更高效地促进视觉功能的研究。
Su-Qi Zou 和 Wu Yin 对本论文贡献相同。
方案
第一部分：构建OKR装置
详细步骤见视频演示。
第二部分：成年斑马鱼的视动反应（OKR）
如果您的实验室已构建了OKR装置，成年斑马鱼OKR实验的关键在于固定鱼体。在本部分中，我们将逐步为您演示操作流程。
我们的装置由以下部分组成，与其他文献中提到的类似。圆形鱼室的外径为7.0 cm，内径为6.5 cm，高为7.0 cm。鱼室周围的转鼓外径为8.5 cm，内径为7.5 cm，高为7.0 cm。转鼓可顺时针和逆时针旋转，转速范围为20~70转/分钟（rpm）。在转鼓外侧贴有一张描图纸，其上绘制有11个黑白条纹循环。照明系统由两个直径为21 cm的环形灯管组成。
图1. 海绵的模型。 中间制作的凹槽是为了确保视野不被遮挡。
- 如图1所示，由两部分组成的海绵。左侧部分为长3 cm × 宽3 cm × 高2 cm。右侧部分为长3 cm × 宽3 cm × 高3 cm。
- 将此海绵置于鱼室底部，并加入约2 cm深的培养用水。应排出隐藏在海绵内的气泡。
- 在海绵右侧部分前端插入一根针，位置约在边缘后方2 mm处。
- 用MS-222麻醉一条成年斑马鱼。
- 将斑马鱼背侧朝上放置于海绵上，使其一侧胸鳍位于第一根针前方。
- 在另一侧胸鳍后方插入第二根针。该针与第一根针配合，可防止斑马鱼身体收缩（参见图2）。
- 用动脉夹夹住其尾部，并将动脉夹固定在粘附于鱼室的一块橡胶（油灰模型）上。
- 在鱼体泄殖孔附近位置插入第三和第四根针。可防止斑马鱼剧烈摆动尾部。
- 第五根针置于第一根与第三根针之间，第六根针位于其对侧。它们可防止斑马鱼身体晃动。
- 在靠近鳃部的位置插入第七和第八根针，以保持头部方向稳定。
- 向鱼室内加入培养用水。
- 待斑马鱼苏醒后，使其适应5~10分钟。
- 打开装置光源，让斑马鱼适应光照环境2分钟。
- 启动电机以驱动光栅，让斑马鱼适应1分钟。
- 开启摄像机并记录眼球运动。
- 在个人计算机上分析眼角6和扫视次数（眼角分析的代表性示例如图2所示）。
图 2. 眼轴与体轴之间的夹角。
a) 当光栅移动方向为鼻侧至颞侧时，我们定义鱼体前方的夹角为负角，鱼体后方的夹角为正角；反之亦然（简要回顾参见参考文献6）。本图中的数字表示标记针的顺序。
b) 正常组一条鱼的OKR分析示例。一段一秒长的视频被转换为一系列帧，使用Image-pro Plus软件测量每帧的眼部角度。本图中每个点代表我们测量的每一帧。
注意事项：
- 所有图钉仅用于防止斑马鱼身体晃动，夹得过紧会对鱼造成伤害。
- 动脉夹因其接触面积较小，可能会损伤尾部。一旦尾部松脱，将很难再次固定该鱼。在某些情况下，建议用绷带包裹尾部。
- 插入鳃部附近位置的第七和第八枚图钉，不应遮挡其对格栅视野的观察。
第三部分. 幼年斑马鱼的OKR
1. 甲基纤维素
幼鱼斑马鱼可在6%甲基纤维素溶液中固定，同时长时间保持存活。按如下方法制备甲基纤维素溶液。
- 将 200 ml ddH2O 放入微波炉中，高火加热约 3 分钟至沸腾。
- 将热水转移至搅拌加热板上，剧烈搅拌。
- 逐渐加入 12 g 甲基纤维素。
- 待甲基纤维素充分分散后，继续搅拌 3 分钟。
- 用冰水冷却溶液至澄清，然后置于 4°C 下保存。
2. 幼体斑马鱼
- 在17:00喂食后，将两条雄性成年斑马鱼和一条雌性成年斑马鱼配对放入交配缸中。次日早晨转移至新的交配缸，并在1小时后收集胚胎。
- 将卵置于胚胎培养基中，在28.5±0.5°C、光照与黑暗周期为14:10的培养箱中孵育。
- 受精后48小时（hpf）卵将孵化，视动反应（OKR）测试可在72 hpf或之后进行。本视频中的幼鱼处于受精后5天（5 dpf）。
3. OKR 实验步骤
- 将装置置于配备CCD相机的体视显微镜下，并打开该装置的光源。
- 在55 mm培养皿中加入20 ml 6%甲基纤维素。
- 将数条幼虫并排置于培养皿中央。
- 在相机视野中引入一个体积约为1 μl的气泡，该气泡可作为反射光栅方向的镜面。
- 启动电机并记录幼虫眼球的运动。
第四部分. 成年斑马鱼的OMR
使用该装置也可进行成年斑马鱼的OMR实验，只需在鱼缸中放置一根柱子以防止鱼游过中心区域（如图3a所示，旋转速度为36 rpm，黑白周期为11个）。
- 将一条鱼放入该鱼用培养室中。
- 在鱼用培养室中央放置一个直径为 2 cm 的柱体。
- 分别在静止光栅和旋转光栅条件下适应一分钟。
- 记录斑马鱼的运动情况。
- 在个人计算机上分析时间重合率（示例见图3b，旋转速度为 36 rpm，黑白周期为 11）。
图 3. 成年斑马鱼的视动反应（OMR）。（a）在鱼缸中央放置一根白色塑料柱，以防止鱼游过中心区域。（b）成年斑马鱼跟随光栅运动的一致率。一致率定义为跟随光栅运动的时间占总记录时间的比例。50% 的值表示鱼处于随机游动状态，而 100% 表示鱼能非常好地跟随光栅运动。使用珠宝镊子对两侧视神经进行约 10 秒的压迫损伤。损伤后，斑马鱼的视动反应表现为随机游动。
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讨论
根据OKR的定义，它是一种动物眼睛自发跟随旋转光栅移动的现象。如果这种行为持续较长时间（例如超过6小时），眼肌可能会疲劳，导致OKR减弱。
成年斑马鱼的视动反应（OMR）已被其他研究者完整描述7。在本视频中，我们仅使用我们的设备展示这种行为。一旦视神经受到挤压损伤，斑马鱼便无法很好地跟随这种光栅图案。
我们使用自行设计的简易装置，对成年斑马鱼和幼体斑马鱼进行了OKR行为测试，并对成年鱼进行了OMR测试，以评估斑马鱼的视觉功能。在本实验中，成年斑马鱼的OKR检测反应在4小时内可保持足够强度，且不会对其造成伤害。这可能使成年斑马鱼的OKR测试在功能研究中更加高效。
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致谢
感谢沈凡女士对斑马鱼饲养工作的支持。本研究得到以下基金资助：胡兵博士（中国科学院“百人计划”、国家自然科学基金 30870833 及中国国家基础科学计划 2009CB941302）。
所有动物实验均按照中国科学技术大学（USTC）动物资源中心和大学动物护理与使用委员会制定的指南和规定进行。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 甲基纤维素 | 西格玛奥德里奇 | M6385 | 黏度 25 cP |
参考文献
- Beck, J., Gilland, E., Tank, D., Baker, R. Quantifying the Ontogeny of Optokinetic and Vestibuloocular Behaviors in Zebrafish Medaka, and Goldfish. J Neurophysiol. 92, 3546-3561 (2004).
- Brockerhoff, S. Measuring the optokinetic response of zebrafish larvae. Nature Protocols. 1, 2448-2451 (2006).
- Emran, F. OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 19126-19131 (2007).
- Rinner, O., Rick, J., Neuhauss, S. Contrast Sensitivity, Spatial and Temporal Tuning of the Larval Zebrafish Optokinetic Response. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 137-142 (2005).
- Roeser, T., Baier, H. Visuomotor Behaviors in Larval Zebrafish after GFP-Guided Laser Ablation of the Optic Tectum. The Journal of Neuroscience. 23, 3726-3734 (2003).
- Easter, S., Nicola, G. The Development of Vision in the Zebrafish (Danio rerio). Developmental Biology. 180, 646-663 (1996).
- Maaswinkel, H., Li, L. Spatio-temporal frequency characteristics of the optomotor response in zebrafish. Vision Research. 43, 21-30 (2003).
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