结构功能分析中蛋白质浓度准确性对动力学与亲和力测定的重要性

摘要

我们采用Biacore X100进行无标记蛋白质相互作用分析，通过动力学表征研究多种半胱氨酸蛋白酶抑制剂B突变体与木瓜蛋白酶的结合，从而实现结构-功能分析。无校准浓度分析（CFCA）可在无需标准曲线的情况下，测定保持结合活性的蛋白质浓度。我们证明，利用CFCA确认浓度可提高动力学分析的可靠性，即使重组蛋白的活性降低，仍能可靠地测定其动力学常数。

摘要

在本研究中，我们利用Biacore X100通过实时无标记分析方法，探究牛源性半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B与一种无催化活性的植物半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶（papain）（图1）之间的相互作用。我们构建了多个在与木瓜蛋白酶相互作用区域含有单点突变的cystatin B变异体。针对每种cystatin B变异体，我们采用无需校准的标准品浓度分析法（CFCA）测定其特异性结合浓度，并将所得结果与通过A₂₈₀. 之后，使用单周期动力学（SCK）测量每种半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变体与木瓜蛋白酶结合的动力学。我们发现，在所检测的四种半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变体中，有一种仅表现出部分结合活性。这种部分活性由CFCA揭示，表现为关联速率常数（k_a）和亲和力（K_D），相较于使用总蛋白浓度计算的值。在结构-功能研究中，将CFCA与动力学分析相结合，有助于获得可靠的结果，并帮助正确解读相互作用机制。

方案

图1. 半胱氨酸蛋白酶抑制剂B（蓝色）与木瓜蛋白酶（黄色）复合物的三维结构。突变的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B残基以红色显示。

1. 使用Biacore系统进行无标记相互作用分析的原理

在使用Biacore系统的典型无标记结合实验中，一种称为“配体”的生物分子被固定在传感器芯片表面。通过流路系统将与其结合的分子（称为“分析物”）输送至芯片表面进行检测。当分析物与配体结合时，表面累积质量的变化通过表面等离子共振（SPR）被检测到。SPR响应信号与结合的分析物量成正比。

由于结合过程是实时测量的，因此可以确定特定相互作用的动力学结合和解离速率常数。根据这些常数，可计算出平衡解离常数作为亲和力的指标。也可以通过稳态结合数据来计算亲和力。类似的方法还可用于确定与表面配体特异性结合的蛋白质浓度。

2. 分析蛋白质-蛋白质相互作用的动力学特性

在 Biacore X100 中，可使用单周期动力学进行动力学分析。在单周期动力学实验中，分析物的浓度梯度在单个分析周期内依次注入，且各次注入之间无需再生传感器表面。因此，当难以找到合适的再生条件时，单周期动力学可实现动力学分析。

在收集完动力学实验的数据后，Biacore X100 分析软件通过将数据拟合至相互作用模型，计算出 k_a、k_d 和 K_D 的数值。

3. 蛋白质浓度测定方法

分析生物分子之间的相互作用对于理解其功能至关重要。表征蛋白质与其他蛋白质、核酸或小分子之间的结合是生物化学研究的基础，并广泛应用于药物发现等多个领域。

为了准确测量两种相互作用蛋白之间的相互作用动力学，必须知道用作分析物的实验样品中特异性结合蛋白的浓度。通常使用分光光度计在 A₂₈₀ 处的读数或 Bradford 试剂等比色法测定总蛋白浓度。然而，蛋白杂质可能会影响结果。更重要的是，总蛋白浓度包含了蛋白的活性与非活性形式。特别是在重组蛋白的情况下，由于错误折叠可能导致蛋白失活，因此确定样品中特异性结合蛋白所占比例尤为重要。

在Biacore X100中，与特异性结合活性相关的浓度可以通过将结合响应水平与已知标准品建立的校准曲线进行比较来确定，也可以采用近年来引入的无需校准品浓度分析（Calibration-Free Concentration Analysis, CFCA）方法。CFCA不依赖于标准品，因此在研究突变蛋白形式时特别有用，因为在这些情况下通常无法获得标准品。

在CFCA实验中，当样品向芯片表面扩散的速率是限速步骤时，需在不同流速下测定初始结合速率。根据初始结合速率计算特异性结合浓度时，需考虑分析物的扩散系数、流通池的尺寸以及流速等因素^1,2。

在动力学实验中，分析物的浓度用于根据实验数据计算动力学结合速率常数和亲和力。CFCA 和 Biacore 系统中的动力学测量均依赖于相同的相互作用特性。因此，使用通过 Biacore 分析确定的特异性结合浓度，而非总蛋白浓度，可提高实验结果的可靠性。

4. 使用 Biacore 分析表征半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 与木瓜蛋白酶之间的相互作用

哺乳动物胱抑素B是一种可逆、竞争性且紧密结合的蛋白酶抑制剂，主要抑制木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶，尤其是组织蛋白酶B、H、K、L和S。这些蛋白酶主要参与细胞内非选择性的蛋白质降解过程。人们认为，胱抑素能够保护细胞和组织免受这些酶不适当的蛋白水解作用。此外，它们还能使寄生虫和病毒来源的半胱氨酸蛋白酶失活，可能参与抵御此类病原体入侵的防御机制。同时，胱抑素还可抑制多种植物来源的半胱氨酸蛋白酶，例如常用于结构-功能研究中的模型酶——木瓜蛋白酶。胱抑素B与木瓜蛋白酶形成的复合物的三维结构³显示，两种蛋白之间的相互作用主要由疏水性接触主导，从抑制剂一侧来看，这些作用力来源于N端和C端以及两个发夹样环区（图1）。在本研究中，我们利用含有定点突变的牛源胱抑素B变体，探讨其C末端及第二个结合环在与木瓜蛋白酶结合过程中的重要性。首先测定所用的四种胱抑素B变体以及野生型蛋白的特异性结合浓度。在确定了有活性的胱抑素B的特异性结合浓度后，使用Biacore X100测定野生型及突变型胱抑素B与木瓜蛋白酶结合的反应速率常数和亲和力常数。

5. 仪器与试剂

1. 半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的变异体Cys3Ser/His75Gly、Cys3Ser/Leu73Gly、Cys3Ser/Tyr97Ala和Cys3Ser的制备方法如前所述⁴。所有突变体均在第3位点含有额外的半胱氨酸至丝氨酸取代，以防止形成二硫键连接的无活性半胱氨酸蛋白酶抑制剂B二聚体。
2. 木瓜蛋白酶靶标也按先前所述方法制备⁵。该靶标为S-(甲硫基)木瓜蛋白酶（MMTS-木瓜蛋白酶），其活性裂隙中的Cys25位点连接有甲硫基团，从而使蛋白酶失去催化活性。
3. 使用Biacore X100结合Biacore X100 Plus软件包来测定和分析特异性结合浓度及结合动力学。
4. 使用Biacore胺偶联试剂盒将MMTS-木瓜蛋白酶固定在CM5传感器芯片上。
5. 实验在25°C下进行，缓冲液组成为：0.01 M Hepes（pH 7.4）、0.15 M NaCl、0.0034 M EDTA和0.05%聚山梨酯20。
6. 每次检测不同半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变异体后，传感器表面以10 μl/min的流速用20 mM NaOH再生30秒。

6. 配体 MMTS-木瓜蛋白酶的固定化

用于CFCA分析的MMTS-木瓜蛋白酶共价连接

CFCA 依赖于在分析物分子向表面扩散受限（质量传递限制）的条件下测量结合速率。高配体固定化水平有利于实现这一条件。MMTS-木瓜蛋白酶的固定化采用 Biacore X100 控制软件中的固定化向导进行设置和运行。

1. 以10 μl/min的流速注入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）与碳二亚胺（EDC）的混合物，持续7分钟，以活化流通池2的表面。流通池1保持未修饰状态，作为参比表面使用。
2. 以5 μl/min的流速在pH 4.5的醋酸钠缓冲液中注入浓度为50 μg/ml的MMTS-木瓜蛋白酶，持续15分钟。
3. 以10 μl/min的流速注入乙醇胺，持续7分钟，以封闭剩余的活性酯基团。

整个偶联过程应在2号流通池中固定约3000 RU的MMTS-木瓜蛋白酶。

用于动力学分析的 MMTS-木瓜蛋白酶共价连接

用于动力学分析的MMTS-木瓜蛋白酶固定化采用相同的步骤，唯一的区别在于，动力学分析中固定化水平需保持较低，以避免结合速率受到扩散限制。在此步骤中，流路池1同样保持未修饰状态，以便作为参考表面使用。

4. 按照7.1步骤使用NHS和EDC混合物活化表面后，注入浓度为1μg/ml的MMTS-木瓜蛋白酶，持续50秒。随后按照步骤7.3注入乙醇胺，使表面失活。

此步骤后，偶联水平应约为 50 RU。

7. 使用CFCA检测法测定胱抑素B浓度

1. 根据 Biacore X100 Plus 软件包中的 CFCA 向导设置 CFCA 实验。将约 10 nM 的蛋白质以 10 和 100 μl/min 的流速分别重复进样 48 秒。每次循环之间用 20 mM NaOH 再生表面。
2. 为每个流速设置空白进样对照。
3. 然后使用 Biacore X100 Plus 软件包分析软件中的 CFCA 评估功能，从结合数据（图 3）中确定蛋白质浓度。
   
   
   图 2. 野生型半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 的 CFCA 分析结果。从流速为 10 和 100 μl/min 时获得的传感图中提取出特异性结合浓度数据。
   
   
   图 3. 通过 A₂₈₀ 测定法（n=3）和 CFCA（n=2）测定的突变体浓度。标准误差以误差线表示。摩尔吸光系数的计算方法如文献 (6) 所述。可观察到 Cys3Ser/Leu73Gly 突变体通过两种方法测得的浓度值存在显著差异。
4. 将 A₂₈₀ 测定法与 CFCA 测定法所得浓度进行比较，可以明显看出，尽管大多数情况下蛋白质完全具有活性，但对于 Cys3Ser/Leu73Gly 变体，其活性蛋白所占比例非常低（图 3）。下表显示了半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 各变体的活性相对于 A₂₈₀ 测定总浓度的比例。

   样品	CFCA 相对于 A280 的比例 (%)
   野生型	94
   Cys3Ser/His75Gly	101
   Cys3Ser/Leu73Gly	9
   Cys3Ser/Tyr97Ala	99
   Cys3Ser	83

8. 测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂B与木瓜蛋白酶结合的动力学

1. 根据 CFCA 测量结果，为每种半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 变体配制浓度范围为 2.5 至 40 nM 的两倍稀释系列。
2. 使用 Biacore X100 中的动力学向导，采用单循环方法设置动力学实验。表面在每次进样之间不进行再生，而是在每个分析周期结束后使用 20 mM NaOH 作为再生溶液进行再生。
3. 设置实验时，使每个含样品的循环前后均包含一个空白循环，即在空白循环中注入缓冲液而非样品。
4. 使用 Biacore X100 中的动力学评估功能，在拟合 1:1 相互作用模型之前，自动对参考扣除数据进行空白扣除。
5. 图 4 显示了半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 变体与木瓜蛋白酶结合所获得的实验数据。下表总结了动力学分析中获得的结合与解离速率常数以及平衡解离常数。

   样品	ka (M-1 s-1)	kd (s-1)	KD (M)
   野生型	1.8 x 106	0.41 x 10-3	2.3 x 10-10
   Cys3Ser/His75Gly	1.1 x 106	1.7 x 10-3	1.5 x 10-9
   Cys3Ser/Leu73Gly	1.1 x 106	23 x 10-3	2.2 x 10-8
   Cys3Ser/Tyr97Ala	1.7 x 106	12 x 10-3	7.1 x 10-9
   Cys3Ser	0.9 x 106	0.53 x 10-3	5.8 x 10-10

   
   
   
   图 4. 采用单循环动力学测定的半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 变体与 MMTS-木瓜蛋白酶结合的动力学曲线。传感器图显示了经过空白扣除和参考扣除的数据，黑色叠加线为 1:1 相互作用模型的动力学拟合结果。
6. 尽管突变体的结合速率与野生型蛋白相当（图 5，上图），但突变体的解离速率常数可高出近两个数量级，相应地平衡解离常数也增加（图 5，下图）。
   
   
   图 5. 速率常数和亲和力常数的计算基于 CFCA 获得的浓度。图中展示了各突变相关的 k_a、k_d 和 K_D 的变化情况。
7. 由于样品浓度是根据实验数据计算结合速率常数时的一个参数，因此其准确性至关重要。若使用 A₂₈₀ 测量值而非 CFCA 确定的浓度，则会得出 Leu73 对结合速率具有重要影响的结论，因为该替换似乎导致其结合速率比其他半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 变体慢约 10 倍。然而，在此情况下，CFCA 测得的特异性结合浓度仅占总蛋白的约 10%。当考虑这一因素后，可以明确 Leu73 变体的结合速率与其他变体相似。因此，CFCA 能够对 k_a 和 K_D 进行准确评估，从而实现对相互作用机制的正确解读。

讨论

本研究中，为评估半胱氨酸蛋白酶抑制剂B与木瓜蛋白酶相互作用中第二结合环及C末端的重要性，制备了四种突变体及野生型半胱氨酸蛋白酶抑制剂B。该研究展示了利用Biacore X100测定特异性结合浓度并分析蛋白质-蛋白质相互作用动力学的优势与便捷性，有助于理解结构与功能之间的关系。我们发现，总蛋白浓度的测定无法揭示结合活性降低的蛋白变体，这在本研究中会导致结合亲和力和动力学参数测定出现显著测量误差。通过Biacore X100结合循环微量进样分析（CFCA）确定了半胱氨酸蛋白酶抑制剂B各变体的特异性结合浓度。将CFCA测得的浓度数据用于动力学分析，获得了可靠的速率常数和亲和常数，从而实现了对相互作用机制的正确解读。

突变体亲和力的降低几乎完全是由于 k_d 值增加所致，而 k_a 仅受到轻微影响。该现象表明，第二个结合环区域和C末端对抑制剂与木瓜蛋白酶结合速率并不重要，而是主要通过在复合物形成后使抑制剂保持与酶的结合，从而贡献于结合亲和力。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Biacore™ X100 系统	GE Healthcare	BR-1100-73	http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html
Biacore™ X100 Plus 套件	GE Healthcare	BR-1007-98	http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html
CM5 传感器芯片	GE Healthcare	BR-1000-14	http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html
胺偶联试剂盒	GE Healthcare	BR-1000-50
乙酸盐缓冲液 pH 4.5，50 ml	GE Healthcare	BR-1003-50
HBS-EP+ 缓冲液 10X，4 × 50 ml	GE Healthcare	BR-1008-26
塑料小瓶 11 mm	GE Healthcare	BR-1002-87
橡胶盖，2 型	GE Healthcare	BR-1004-11