本方案描述了一种用于在化学效应物的稳定浓度梯度中研究细菌趋化性的微流控装置的开发。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
趋化性使细菌能够接近吸引性化学物质的来源或避开排斥性化学物质的来源。细菌通过将当前浓度与几秒前检测到的浓度进行比较，持续监测特定趋化效应物的浓度。这种比较决定了细菌运动的总体方向。尽管在自然界中常常同时存在多种相互竞争的浓度梯度，但传统的研究细菌趋化性的方法在量化细菌对吸引物和排斥物浓度梯度的迁移反应方面并不理想。在此，我们描述了一种微流控趋化性模型的建立方法，该模型可向细菌施加精确且稳定的趋化效应物浓度梯度，并定量研究其对所施加梯度的响应。该装置具有良好的通用性，可通过扩散混合轻松生成任意所需绝对浓度和梯度强度的浓度梯度。本研究通过细菌对Escherichia coli RP437 对氨基酸和镍离子的浓度梯度。
方案
1. 采用标准SU-8光刻技术制备硅模板1(未在本视频中展示.
- 采用标准的SU-8光刻方法制备用于制造包含微流控网络和趋化室的PDMS模具的SU-8“母模”（SU-8 2025，MicroChem，Newton，MA）。此类母模可在任何微加工设施中制备（例如斯坦福微流控制造中心；http://thebigone.stanford.edu/foundry/）。
- 在进行PDMS复制之前，将SU-8母模置于连接真空源的干燥器中，并暴露于氟硅烷蒸气中，以促进PDMS从母模上顺利脱模。将一滴氟硅烷滴加到纸巾上，抽真空1分钟。解除真空后静置30分钟，使氟硅烷完成沉积。将SU-8母模保存于密闭容器中以备后续使用。
2. 从SU-8模具复制成型PDMS：流体层和控制层通过从SU-8模具复制成型PDMS制备。
- 按10:1的质量比混合PDMS预聚物与交联剂，并在真空干燥器中脱气1小时（或直至PDMS混合物中的气泡完全去除）。
- 将SU-8模具置于培养皿中，小心地将PDMS混合物倒在SU-8模具表面，达到所需厚度。
- 将含有PDMS和SU-8母模的培养皿在80°C下加热2小时，使PDMS固化。
- 从加热板上取下已固化的带有PDMS的SU-8母模，小心剥离PDMS模具。所需结构将被嵌入PDMS模具中。
- 使用20号钝头针在PDMS模具上打孔，用于连接梯度发生器和细胞进样口的管路。
3. PDMS 装置的键合：
- 用异丙醇清洁玻璃显微镜载玻片，并用氮气或气流吹干。
- 将PDMS和玻璃载玻片置于等离子体灰化仪中进行氧气等离子体处理。
- 将PDMS模具与玻璃载玻片接触，将接触后的载玻片和PDMS模具在65°C下加热15分钟。
4. 组装PDMS装置
- 使用剃刀刀片将导管以45°角切割至设备所需的正确长度。
- 使用镊子将导管的一端插入设备上打好的孔中（例如出口）。
- 使用镊子将一根钝头30号针头插入导管的另一端。
- 对所有其余孔重复步骤4.2。
- 用3 mL注射器收集1 mL趋化缓冲液（CB），注意从注射器中排除气泡。
- 将针座固定在出口导管的一端。
- 向针座中加入CB，并轻敲针座以去除任何气泡。
- 将少量CB从注射器尖端推出，并在不夹带空气的情况下将3 mL注射器连接到针座上。
- 推动CB流经设备，直到所有剩余的针座均充满CB。此步骤应可去除大部分气泡。
- 用含有待测趋化效应物适当浓度的CB填充两个500 μL注射器。通过推出少量液体形成液滴，将液滴接触针座中的液体并连接，以消除气泡的形成。
- 类似地，将装有CB的注射器连接至细菌入口。当将细菌引入设备时，此注射器将被移除。
5. 高度运动性菌株的培养 E. coli
- 过夜培养菌液 E. coli RP437 菌株在 20 mL 胰蛋白胨肉汤（TB）中携带 GFP 表达质粒 32°C 振荡培养。加入适当浓度的抗生素以维持质粒。在本方案中，我们使用低拷贝质粒pCM182，用于在设备中基于荧光检测细菌。对于 E. coli，于适宜条件下培养细胞 32°C 建议在高运动性条件下进行，因为较高温度下运动性较低。
- 使用过夜培养物接种20 mL TB培养基于250 mL锥形瓶中，使600 nm处的光密度约为0.05。将培养物置于摇床中振荡培养 32°C.
- 在 OD 值达到指定条件时收获细胞600 约0.35至0.45，通过400 × g低速离心5分钟获得。
- 重悬细胞至 OD600 在含有预期位于通道中部浓度的趋化效应物的CB中，OD值约为0.35。
- 加入RFP标记的死细胞，使其OD值达到600 约为0.35的GFP表达活细胞。死亡（红色）细胞用作内部对照，以确保任何迁移现象并非由流动效应引起。
6. 监测趋化性
- 从细胞进样针接头中移除部分 CB。用细胞悬液重新填充。
- 缓慢吸取重悬的细胞至50μL注射器中。此步骤需缓慢操作，以免鞭毛受到剪切力损伤，从而降低细胞运动能力。
- 将50μL注射器连接至进样针接头，操作方法如步骤4.10所述。
- 将装置置于配备高速相机的荧光显微镜载物台上，用于图像采集。将进样端的注射器（包括500 μL梯度注射器和50 μL细胞注射器）放入注射泵中，并启动流体流动，以形成浓度梯度并使细胞流经管路。
- 当细胞进入趋化室后，等待约20分钟，使系统稳定后再开始成像。
- 在趋化室不同位置（对应不同暴露时间）采集绿色（活细胞）和红色（死细胞）荧光图像。通常，我们在每个位置以3秒间隔采集100张图像。
7. 数据分析：以下步骤可使用任何市售的图像分析软件（例如 ImageJ、Metamorph）或使用 Matlab 编写的简单代码完成。
- 去除图像中的背景像素（即设定阈值像素强度，并移除所有强度低于该阈值的像素）。这可以最大限度地减少分析中的噪声。
- 利用死亡细胞（红色荧光）的位置确定图像的中心。由于死亡细胞不表现出趋化性，因此该位置代表细胞进入趋化室的位置，在无迁移的情况下即为可被检测到的位置。
- 在图像中定位活细胞（绿色荧光）。
- 将图像划分为若干通道，并确定每个通道中的活细胞数量。在我们之前的研究3中，将1050 μm宽的趋化室划分为64个通道，每个通道约16 μm宽。
- 对所有图像重复步骤7.1至7.3，并对所有图像中每个通道的细胞计数进行累加。这给出了在整个实验持续时间内每个通道检测到的总细胞数。
- 计算趋化分配系数（CPC），该系数表示迁移方向，方法如下：位于死亡细胞高浓度侧（右侧）和低浓度侧（左侧）的每个细胞分别赋予+1和-1的乘数。也就是说，沿浓度梯度向上迁移的细胞乘以+1，而沿梯度向下移动的细胞乘以-1。将所有乘积值相加后，再归一化到检测到的细胞总数。例如，CPC值为0.40表示有比低浓度侧多40%的总细菌移动到了高浓度侧（即趋化效应物为引诱剂，因为检测到更多细菌沿梯度向上移动）。
- 计算趋化迁移系数（CMC），该系数根据细胞迁移的距离对迁移进行加权，方法如下：根据细胞迁移距离的比例对每个通道的细胞计数进行加权。移动至最远高浓度位置（通道64）的细胞赋予+1的权重因子，移动至高浓度侧一半位置的细胞赋予+0.5的权重因子，而移动至最远低浓度位置的细胞则赋予-1的权重因子。将所有加权后的细胞计数相加，并归一化到细胞总数以得到CMC。
代表性结果3,4：
我们已使用微流控装置（图1A) 用于研究趋化性 E. coli 在吸引物（天冬氨酸、自诱导物-2）和排斥物（NiSO₄）的浓度梯度中4，吲哚）3,4典型的趋化性菌株5 E. coli 表达GFP的RP437，以及卡那霉素灭活的 E. coli 表达红色荧光蛋白以监测流体效应的TG1细胞。在其中形成的浓度梯度 μFlow 设备如图所示 图1B将细胞入口封闭，使其无液体流过，并在装置内建立稳定浓度梯度，范围为0至100 ng/mL的荧光素。通过检测装置内各位置的像素强度，确定荧光素的浓度分布。数据表明，细菌进入趋化室时会遇到一个线性浓度梯度。 图 2A 和 B 显示荧光图像 E. coli RP437 在天冬氨酸梯度（0 100 μM）和 NiSO4 (0 225 μM）。对这些典型趋化吸引物和排斥物的观测反应符合预期。 图3A 显示量化分布 E. coli RP437 在缺乏浓度梯度的情况下（即天冬氨酸的梯度为零），而 图3B和C 显示天冬氨酸和NiSO在梯度中的分布4这些反应的特异性（即迁移偏向性）表现为一种 E. coli RP437 Δ焦油 菌株（即缺乏用于实验的Tar趋化受体的菌株） E. coli 检测天冬氨酸和镍）在天冬氨酸或NiSO₄浓度梯度存在时，并未表现出迁移偏倚4空间分布特征中显现出的趋势与计算得到的CPC值和CMC值一致。迁移的CPC值 E. coli RP437 在天冬氨酸或 NiSO₄ 梯度中的反应4 分别为 +0.33 和 -0.33。相应的 CMC 值分别为 +0.13 和 -0.14。相比之下，CPC 和 CMC 值在 E. coli RP437 Δ焦油 在天冬氨酸或NiSO₄梯度中进行菌株培养4 可忽略不计。此外，在天冬氨酸无梯度条件下，CPC 和 CMC 分别为 +0.03 和 +0.02，表明在无梯度情况下迁移无偏向性。
图1. 装置示意图与浓度梯度。
(A) 微流控趋化装置的示意图。该装置由一个梯度混合模块（20 × 100 × 18750 μm）和一个趋化观察模块（20 × 1050 × 11500 μm）组成。进入装置的两条梯度通道宽度为500 μm，细菌入口宽度为50 μm。插图显示了信号分子（灰色）的梯度以及细菌对其产生的迁移响应。活细菌以实心椭圆表示，死细菌以空心椭圆表示。(B) 在装置中生成了0至100 ng/mL荧光素的浓度梯度，并通过荧光显微镜成像。在30分钟后采集荧光图像，并通过图像分析进行定量。
图2. 趋化性 E. coli 微流控装置中的 RP437
E. coli RP437 被暴露于 (A) 0- 的梯度中100 μM L-天冬氨酸或（B）0-225 μM NiSO4 在装置中，活细菌（绿色）向L-天冬氨酸迁移或远离镍的运动情况每2.5秒成像一次，持续30分钟。死亡细菌（红色）用作评估装置内流体效应的对照。图像通过自行开发的分析程序3进行量化。所示数据来自三次独立实验，为代表性的伪彩图像。
图3：对经典趋化吸引物和排斥物的迁移模式进行定量分析。
RP437菌株在微流控装置中对以下物质的响应空间分布：(A) 均一浓度的100 μM L-天冬氨酸（即无浓度梯度）；(B) 0 至 100 μM 的天冬氨酸浓度梯度；以及 (C) 0 至 225 μM 的NiSO4浓度梯度。死细胞的分布以实线表示，RP437细胞的分布以虚线表示，RP437 eda+ Δtar细胞的分布以点线表示。所示数据为三次独立实验的平均值。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
趋化分配系数（CPC）和趋化迁移系数（CMC）的计算方法如 Mao et al5 所述。若在高浓度侧检测到细胞，则赋予其值 +1；若在低浓度侧检测到细胞，则赋予其值 -1。将所有值相加后除以细胞总数，得到 CPC。CPC 的符号（正或负）表示迁移方向（朝向或远离信号）。尽管 CPC 可指示细胞是否将某种化学物质作为引诱剂或排斥剂作出响应，但它无法量化趋化反应的程度。为此，我们通过将细菌在装置宽度方向上的空间分布剖面划分为 64 个区段（细胞进样口两侧各 32 个区段），并根据迁移距离为每个区段中的细胞分配加权因子，从而计算 CMC。距离中心最远的区段（区段 1 和 64）乘以 +1（= 31.5/31.5）或 -1，因为其中包含迁移距离最大的细胞；接下来的两个区段（2 和 63）乘以 +0.968（= 30.5/31.5）或 -0.968；最后两个区段（即最靠近细胞进样口的区段 32 和 33）乘以 +0.015（= 0.5/31.5）或 -0.015。将加权后的值求和，并归一化至细胞总数，得到 CMC。CMC 为 +1 表示所有细菌完全沿浓度梯度迁移至流动腔室的壁面。在轻微吸引响应的情况下，C...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
本工作部分得到了美国国家科学基金会（CBET 0846453）的支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
参考文献
- McDonald, J. C. Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing. Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).
- Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration. Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).
- Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients. Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).
- Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis. , Humana press. (2009).
- Mao, H., Cremer, P. S., &, M. anson A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
