本文描述了一种在加州海兔（Aplysia californica）中植入四个体内电极以监测摄食行为神经肌肉控制的技术。
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本文内容
摘要
摘要
记录关键神经和肌肉的活动Aplysia在摄食行为过程中进行记录，使我们能够在完整的动物体内研究神经控制的模式。同时记录多条神经和肌肉的活动，可以精确获取神经活动时序的信息。以往的记录方法仅适用于两个电极，而研究更多神经或肌肉则需要整合并平均多个动物的记录数据，由于个体间以及每次反应之间的差异，这种方法难以确定时序和相位的细微细节。植入四个独立电极的成功率极低，原因是粘连组织的形成会阻碍动物进行正常的摄食运动。我们开发了一种新的电极制备方法，减少了电极在动物体内的体积，从而允许动物正常摄食。通过使用多种胶水组合来固定电极，实现了更可靠且持久的电极绝缘，使得记录时间最长可达一周。我们所描述的这种电极制备技术还可进一步扩展以容纳更多电极，并可应用于脊椎动物。
方案
1. 电极制备
- 制作电极时，使用剪刀剪取一段长约2英尺、直径为0.001英寸的漆包不锈钢丝。在线的两端各附上一小团腻子，将导线对折后拧成双绞线，称为差分电极。
- 用胶带固定导线两端，防止其松开。共制作四个差分电极，每个差分电极使用不同颜色的胶带以便识别（图1A）。
- 将其中两个差分电极拧在一起，一端留出2英寸未拧部分，另一端留出1英寸未拧部分。对另外一对差分电极重复此操作（图1B）。
- 将两组已拧合的差分电极进一步拧在一起，确保末端保持未拧状态。将电极组件竖起，在四个差分电极的连接处涂抹家用硅胶，末端保持自由状态。悬挂并静置至少4小时使其完全干燥（图1C）。
- 为绝缘分支部分，将电极组件平放在一块可移动的平板（如木板）上。将末端展开并用胶带固定。在分支前用一小块塑料将电极组件垫高，并用胶带固定。
- 在解剖显微镜下，使用镊子将硅胶均匀涂覆在各分支上。长度为1英寸的末端将置于动物体内，因此应仅涂覆极薄一层硅胶。静置至少3小时使其干燥。
- 将其中一个差分电极的1英寸长末端缩短至2厘米。在每根导线上去除1 cm的硅胶和漆层。将其中一根裸露导线弯成钩状用于记录，另一根导线向上弯曲并远离记录钩，作为接地线。对剩余三个电极重复此步骤。
- 在2英寸长的一端选择四个电极中的一个，使用镊子刮除硅胶和漆层，使两根导线各暴露1 cm的裸露不锈钢丝。将金质连接器焊接到两根导线上。使用实验室胶带固定末端，并保持接地引脚与记录引脚之间的分离。对剩余三个电极重复此操作。
- 在距离钩状端约1.5英寸的电缆上附着一个直径1–2 cm的硅胶球，用于在动物体内固定电极。静置至少1小时使其干燥（图1D）。
图1. 电极组件的制作。（A）单个差分电极，由对折并拧合的导线构成，末端用胶带固定。（B）两个差分电极拧合在一起，末端留有未拧合部分。应使用不同颜色的胶带或其他标记以区分各末端。（C）四个差分电极组合成一个完整的电极组件，形成一根主电缆，两端分别具有独立分支，各分支末端用不同颜色胶带标记。（D）电极组件的最终形态。左侧为用于记录的卷曲钩状结构及每个差分电极的接地线；右侧为焊接到导线上的金质连接引脚，用于连接放大器。在组件左侧附近还设有用于固定的硅胶球。
2. 植入前动物准备
- 选择一只体重约为 350–450 g 的健康动物。该动物在受到小块海藻刺激时，应能以每 3 至 5 秒一次的频率产生咬合动作。完整的手术及电极植入过程应耗时约一小时。
- 为麻醉动物，需注射 30% w/v 的等渗 MgCl2。为防止血液淋巴液和 MgCl2 的流失，可在拔出针头前用速干胶涂抹注射部位。
图 2. 示意图显示动物在电极植入过程中如何被固定，以及切口位置（由标尺指示）。 - 将麻醉后的动物置于解剖托盘中，足部朝下。正对动物头部，将其鳃区转向左侧，使动物部分侧卧并向外倾斜。用大头针固定前部触手（图 2）。
- 将托盘放置在解剖显微镜的载物台上。将托盘支撑成约 20 度角，以抬高头部，并使血液淋巴液积聚在尾部，远离切口区域。
- 使用解剖剪刀，从眼点稍偏右侧开始切口，并向前延伸 1 至 1.5 cm。使用固定在托盘边缘的牵开器将切口撑开（图 2；注意眼点附近标尺所示切口位置）。
- 为暴露口球结构，使用镊子提起皮肤下方的透明膜，并用剪刀剪开一个与主切口相匹配的开口。将膜的边缘塞入牵开器中固定。
3. 电极植入
- 将电极组件放置在显微操作器上，并移至动物切口上方。
- 齿舌神经最难接近，应优先处理。有两种方法可用于接触齿舌神经。
- 首选方法是观察位于BN1与BN2之间的口神经节下方区域。若可见齿舌神经的分支，使用弯成钩状的精细镊子将该分支轻轻挑起（图3中标记为1的神经节下方RN环）。
- 若在肌肉上方无法接触到齿舌神经分支，则可选择第二种方法：在口神经节基部结缔组织旁的I2肌上做一个小切口，由此进入（图3中标记为2的肌肉下方RN）。I2肌的切口必须穿透两层肌肉组织。用直头镊子夹住肌肉切口边缘，再用钩状镊子拉出RN分支。
- 用钩状镊子固定神经的同时，使用另一把镊子将电极钩套入神经上。
- 使用显微操作器将钩子抬高，使神经从口部肌肉团中抬起，并远离其他神经或组织。注意不要过度拉伸神经。
- 用Kim-Wipe纸巾擦干电极，或用注射器吸去多余液体。水分表面张力可能导致神经塌陷，或在神经下方形成水封。无论哪种情况，在涂抹胶水前必须彻底干燥该区域。
- 在钩子基部与神经底部接触处涂抹少量瞬间胶。滴加一滴Aplysia生理盐水或血淋巴以固化瞬间胶。胶水未干时切勿移动任何部件，否则胶水进入导线与神经之间会阻断电连接。
- 再次干燥钩子。在冰袋上混合Kwik-Sil胶。
- 用针尖蘸取少量Kwik-Sil胶，完全覆盖钩子上暴露的金属导线部分，但不要覆盖接地导线。
- 让胶水固化约5分钟，若胶水从钩子某些部位脱离，需重新调整。当用针轻触胶面不再粘附时，即表示已完全固化（图4显示最终配置）。
- 齿舌神经电极固定后，可开始处理I2肌。在BN1与BN2之间的区域，使用钩状镊子钩住并轻轻向上提起两束I2肌，将其与其他肌肉部分分离。采用相同步骤安装电极。
- 口神经2和口神经3易于接触，电极安装方法相同。
- 所有电极安装完毕后，将电极组件推入动物体内，直至硅胶锚定部分进入体内。
- 缝合切口，使突出的电极导线周围闭合，同时保持锚定部分位于动物体内。用瞬间胶加固缝线，确保密封良好。
- 将电极另一端的金质连接头插入一小块聚苯乙烯泡沫中。将动物放回主水箱内的充气隔离容器中，过夜恢复。
图 3. Aplysia 摄食器官（称为口球）的示意图。图中显示了口球神经（BN1、BN2、BN3）、从口球神经节底部发出后深入肌肉下方的齿舌神经（RN），以及电极所连接的 I2 肌肉位置。
图4. 单个电极连接至神经（或肌肉）并用胶固定的示意图。请注意，卷曲钩状电极去绝缘部分直接与神经（或肌肉）接触，通过瞬间胶固定于原位，并使用Kwik-Sil使其与液体介质实现电绝缘。同时请注意，接地电极的去绝缘尖端暴露于液体介质中。
4. 记录
- 将动物连接到记录设备后，置于通气的容器中适应至少1.5小时。在动物适应过程中监测信号，以确认所有电极正常工作且噪声水平较低。
- 使用摄像机记录摄食行为，同时通过计算机记录神经和肌肉电极的信号。利用方波信号同步视频和电极记录，该方波信号控制摄像机视野中的数字计数器，并同时作为额外通道在Axoscope软件中由计算机记录。
- 摄食行为的诱发采用Morton和Chiel于1993年描述的技术。
尽管无脊椎动物无需机构动物使用与护理委员会的正式批准，但我们确保对Aplysia的所有操作均将对动物的伤害和痛苦降至最低，并且所有外科技术均在动物完全麻醉状态下进行。
代表性结果
图 5. (A) 在咽下反应期间，从肌肉（前伸肌 I2）和三条口前神经（齿舌神经 RN、口前神经 2 BN2 和口前神经 3 BN3）同步记录的四通道信号。(B) 自由活动动物在吞食一条预先切割的海藻条（宽 0.5 cm）时，同步视频记录的静态帧，该海藻条以白色标记每 0.5 cm 划分一段，以便在动物摄食过程中清晰观察其移动情况。
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讨论
实现这些记录成功的关键创新是将电极整合到一根电缆中。虽然此前已使用过双电极记录，但扩展至四个独立电极时，常导致手术粘连的形成，从而阻碍动物进行正常的摄食运动。将电极整合为一根电缆可减少动物体内电极的体积，进而降低免疫反应，并使动物活动更加自如。
该操作的另一创新之处在于，将超级胶水与Kwik-Sil结合使用，以将电极固定在神经或肌肉上。此前仅使用超级胶水，但两种胶水的组合效果更可靠，且持续时间比超级胶水长数天；超级胶水在接触水后约3天即会降解。
我们已经证明，可以在完整且正常活动的动物体内植入细胞外电极，以记录或刺激单个已鉴定神经元的胞体活动 [Warman 和 Chiel, 1995; Lu 等, 2008]。因此，本文所描述的多电极技术可用于同时记录并调控四个不同已鉴定神经元的活动，或神经元、肌肉与神经的组合活动。
我们一直使用四电极技术，但该技术可能也适用于更多电极。此外，在一项尚未发表的实验中，这些电极被用于记录大鼠阴部神经的信号，表明该技术的某些方面可能在...
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致谢
我们衷心感谢美国国立卫生研究院（NIH，项目编号 NS047073，资助对象 H.J.C.）提供的资助。我们还要感谢 Catherine Kehl 在 Kwik-Sil 早期实验中的工作，这促使我们将其应用于本研究中。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 表面涂覆珐琅的不锈钢丝 | California Fine Wire Company | 0.001D, 涂层 h | |
| 家用 Silicone II 胶水 | GE Healthcare | ||
| Kwik-Sil 粘合剂 | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Duro Qwik-Gel 超强胶 | Henkel Corp | ||
| A-M Systems model 1700 放大器 | A-M Systems | 滤波设置：100–1000 Hz 神经信号，10–1000 Hz I2 肌肉信号 | |
| Axoscope 10.1 | Molecular Devices | ||
| 金质连接插针 | Bulgin | SA3148/1 | |
| 金质连接插座 | Bulgin | SA3149/1 |
参考文献
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica. J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).
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重印与许可
