使用 GELFREE 8100 分离系统进行基于分子量的液相回收分离

摘要

配套视频介绍了GELFREE 8100分离系统，该系统可根据分子量对复杂的蛋白质样品进行分离，并以液相形式回收各组分。视频阐述了该技术的工作原理、使用方法，并提供了实验结果，包括对分馏后的牛肝匀浆进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的数据。

摘要

GELFREE 8100 分离系统是一种新型蛋白质分离系统，旨在基于分子量进行分离时最大化蛋白质回收率。该系统由一次性使用的、可容纳8个样品的 cartridges 和一台台式 GELFREE 分离仪组成。在分离过程中，阳极和阴极储液槽之间施加恒定电压，每种蛋白质混合物通过电泳作用从加样室进入特制的凝胶柱。蛋白质首先在浓缩胶中富集形成一条紧密条带，随后在分离胶中根据各自的电泳迁移率进行分离。当蛋白质从凝胶柱中洗脱时，它们被捕获并富集在收集室的液相中，完全脱离凝胶。随后，仪器在特定时间间隔暂停，使用移液器收集各组分。此过程重复进行，直至收集到所有目标组分。若在 cartridge 上运行的样品少于8个，未使用的加样室可在后续分离中继续使用。

该新型技术可同时快速、简便地分离多达8种复杂的蛋白质混合物，相较于以往可用的分级分离方法具有多项优势。该系统每个通道可对最多1 mg的总蛋白进行分级，每根色谱柱总计可处理8 mg蛋白。在广泛的分子质量范围内，完整蛋白质可根据其分子量进行分离，同时保留分析物重要的理化性质。液相捕获技术可实现高回收率，且无需进行条带或斑点切割，从而使分级过程具有高度的可重复性¹。

方案

1. 样品蛋白制备

1. 在500 μl的微量离心管中，加入以下成分：

试剂	添加体积：
*蛋白样品（最多 1 mg）	最多 112 μL
上样缓冲液（5X）试剂盒中提供	30 μL
DTT 1M	8 μL
18 Ω H2O	x μL，补足至总体积 150 μL**

2. 在 95°C 下变性样品 5 分钟。冷却至室温。

*待分离的蛋白质总量取决于样品的复杂程度。对于组织匀浆等更复杂的样品，建议每通道上样量为 150-200 μg。

**如果样品体积小于 112 μL，加入 18 Ω H₂O 使最终体积达到 150 μL。

2. 上样 GELFREE 胶条

1. 从铝箔袋中取出 GELFREE 8100 电泳 cartridge。
2. 移除并丢弃封板膜。
3. 使用移液器从 cartridge 的各个腔室中移除保存缓冲液。如果将使用 cartridge 的全部 8 个腔室，可将 cartridge 倒置以排净各腔室中的保存缓冲液。
4. 通过向每个 cartridge 腔室中加入 GELFREE 运行缓冲液，准备上样，具体操作如下：

GELFREE 胶条室	需加入的 GELFREE 电泳缓冲液体积
阳极缓冲液储液槽	8 mL
阴极缓冲液储液槽	6 mL
收集室	每个 100 μL

5. 移除并丢弃样品加样室中的任何缓冲液。
6. 使用8通道移液器将150 μL样品加入加样室中。
7. 将装有样品的 cartridge 放入 GELFREE 8100 分离系统中。降下电极阵列并关闭盖子。

3. 运行检测卡

1. 使用仪器的触摸屏显示屏，按下 方法 单击按钮以查看预设方法列表。每种预设方法均包含特定的电压设置和基于时间的暂停程序，旨在分离特定分子量范围内的蛋白质。GELFREE 8100 将根据方法中设定的时间间隔自动暂停，以便进行组分收集。
2. 一旦确定了合适的方法，按下 获取 按钮，然后使用屏幕上的小键盘输入所需预设程序的编号。按下 好的，然后按下 应用 按钮。所应用的方法将显示在主屏幕底部。
3. 要选择运行中将使用的通道（样本数量），请按下 通道 主屏幕上的按钮。要选择全部八个通道，请按 select 全部然后，按压 完成 返回主屏幕。
4. 确保安全盖已关闭，且屏幕底部的指示灯为绿色。
5. 开始蛋白质分离时，按下 开始当需要收集组分时，组分收集站将自动暂停。 注意：系统运行期间，屏幕左侧方框中显示的圆圈表示各通道的状态。绿色圆圈表示通道处于活动状态，黄色圆圈表示仪器已暂停，红色圆圈表示通道出现故障。通道状态圆圈右侧显示施加的电压和电流。只有当状态圆圈变为黄色且仪器屏幕上出现文本警报时，方可取出样品。
6. 打开仪器盖子，使用8通道移液器从每个收集室中吸取150 μL液体以去除组分。
7. 去除各组分后，向每个通道加入 100 μl GELFREE Running Buffer，上下吹吸两次，对收集室清洗两遍。
8. 洗涤后，向收集室中重新加入 100 μL GELFREE 运行缓冲液，盖上盖子，并按下 继续 按钮
9. GELFREE 8100 将持续运行至下一个时间间隔。实验剩余总时间显示在屏幕右侧。切换显示 剩余时间，已用时间 和 暂停的时间， 按下显示时间的方框上方的按钮。
10. 所有组分收集完毕后，可立即用于后续下游实验，如等电聚焦或凝胶电泳，或用于液相色谱-质谱联用及免疫亲和分析。

4. 代表性结果

使用 GELFREE 分离系统将 200 μg 牛肝匀浆分成 12 个组分，每个组分各一份。每个组分取 6 μL 在标准的一维 SDS-PAGE 凝胶上电泳，并进行银染。如图 1 所示，蛋白质样品被分离为 12 个不同的组分，分子量范围从 3.5 kDa 到 150 kDa。泳道 1 和 14 中还显示了分子量标准品（ColorBurst，Sigma）。本图展示了使用 GELFREE 8100 系统进行蛋白质分离所达到的高回收率。本图所示凝胶代表了从 200 μg 蛋白质中回收的蛋白的 4%。

图1. 使用 GELFREE 分离系统分离牛肝匀浆中的蛋白质。 每个150 μL组分取6 μL上样，在一维SDS-PAGE凝胶上电泳并进行银染。同时按指示上样了分子量（MW）标准蛋白。请点击此处查看图1的放大版本。

讨论

GELFREE 8100 分离系统提供了一种快速、简便且可重复的方法，用于将复杂的蛋白质样品按分子量大小分离为不同的组分。这种新型的分离方法无需进行条带或斑点切割，可在90分钟内实现宽分子量范围内蛋白质的分离。该方法能够加载相对大量的样品，并以液相回收各组分，特别适用于低丰度蛋白质的分离与分析，而这些蛋白质通常较难被检测。所得的各组分可广泛应用于多种实验技术，如液相色谱-质谱联用（LC-MS）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）以及免疫印迹（immunoblotting）。