评估二维（2D）结晶实验以形成有序的膜蛋白阵列，是电子晶体学中一项极为关键且困难的任务。本文介绍了我们用于筛选和鉴定主要分子量在15–90 kDa范围内的小型膜蛋白二维晶体的方法。
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方法文章
通过电子晶体学评估小膜蛋白的二维结晶实验以用于结构生物学研究
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
电子晶体学已发展成为一种可用于研究膜蛋白以及可溶性蛋白结构与功能问题的方法，既可作为三维结晶和X射线晶体学的替代手段，也可与之结合使用。通过透射电子显微镜（EM）对二维（2D）晶体进行筛选，是寻找、优化和选择可用于冷冻电镜高分辨率数据收集样品的关键步骤。本文介绍了识别大尺寸有序以及小尺寸二维晶格阵列的基本步骤，这些阵列有可能为结晶条件的优化提供关键信息。
通过在电子显微镜下使用不同的放大倍数，可获得一系列关键参数的数据。低倍放大提供有关形态和膜尺寸的有价值信息。在高倍放大下，可确定可能存在的有序结构及二维晶体的尺寸。在此背景下，本文描述了如何在高倍放大下利用CCD相机和在线傅里叶变换来评估蛋白脂质体的有序性和尺寸。
尽管膜蛋白的二维晶体通常通过透析重构成法进行培养，但该筛选技术同样适用于利用单分子层、天然二维晶体以及可溶性蛋白有序阵列所获得的晶体。此外，本文所述方法也适用于更小或更大尺寸的膜蛋白二维晶体的筛选，其中较小的蛋白质在鉴定时需要与本文示例相同的谨慎程度，而较大蛋白质的晶格在筛选早期阶段可能更容易被识别。
方案
1. 二维结晶实验的载网制备
- 采用负染法准备碳膜覆盖的400目铜质电镜载网。醋酸铀酰常被用作负染剂，其染色液可在使用前存放数月，并且适用于载网的长期保存。相比之下，其他负染剂（如甲酸铀酰）虽然染色效果优异，但需新鲜配制1。为快速制备大量用于二维晶体筛选实验的载网，可采用一种改良的负染法：将2 μL样品溶液滴加至覆有碳膜的电镜载网上，孵育60秒；随后用撕成条状的Whatman #4滤纸从边缘吸去液体（图1；视频），立即滴加2 μL 1%醋酸铀酰溶液，30秒后再次从载网边缘吸去染液。使用滤纸的撕裂边缘轻触载网边缘，可确保在不移除蛋白脂质体的前提下有效去除多余液体。此外，在载网边缘处干燥有助于更好地保持碳膜完整性。在载网的制备与操作过程中需格外小心，因为脆弱的碳膜一旦破裂，将导致样品无法附着，并可能造成对样品形态的错误判断。传统上，载网制备通常使用5 μL的较大样品体积，但通过将体积减少至2 μL或更少，可有效节约珍贵样品2。
- 为获得尽可能大的膜结构，部分样品在透析缓冲液中需含有高浓度甘油或蔗糖（10–20%）。然而，这可能对载网制备产生不利影响，因为甘油或蔗糖具有高黏性，会阻碍醋酸铀酰充分渗透缓冲液，从而导致膜结构染色不完全，进而掩盖可能存在的晶格结构。解决方法包括：通过离心更换缓冲液，替换为不含甘油/蔗糖的缓冲液（未展示），或在负染前参照冷冻电镜常用技术3,4，用缓冲液或不含甘油/蔗糖的缓冲液对载网进行一次或多次洗涤。
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讨论
对样品的准确评估需要仔细分析足够数量的膜。例如，在超过180个成像的蛋白脂质体中，结晶阵列比例低至2%的样品仍提供了关键信息，可用于快速优化二维结晶条件7。
当蛋白质发生沉淀时，可在低倍镜下观察后放弃对该网格的进一步筛选，尽管偶尔会出现蛋白质的部分沉淀。然而，即使小于100 nm的微小膜结构也能提供有关有序性的有用信息，因此可在后续透析实验中采取相应参数以增大二维晶体的尺寸。
各类实验室正在逐步引入不同程度的自动化技术，以用于筛选过程8,9。然而，样品仍需经过本文所述的二维晶体尺寸、形貌和有序性的评估步骤。未来，或许将能够以更高分辨率分析越来越小的二维晶体数据，这使得这些筛选步骤以及对更小晶区进行评估的难度进一步增加，其重要性也愈发突出。
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致谢
我们感谢合作者提供了宝贵的蛋白质样品，这些样品有助于我们积累相关方法的经验和观察结果。Günther Schmalzing 慷慨地为 FR 提供了参与本项目的机会。感谢 Barbara Armbruster、Jacob Brink 和 Deryck Mills 在设备方面提供的杰出帮助和建议。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 HL090630 提供经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 镀有碳膜的400目铜制透射电镜载网 | |||
| 镊子：普通镊子和防毛细管镊子 | Dumont #5 和 Dumont N5AC 或类似产品 | ||
| 微量移液器及移液器吸头 | |||
| Whatman #4 滤纸 | |||
| 1% 醋酸铀酰 | |||
| 待检测二维晶体的透析样品 | |||
| 不含甘油/蔗糖的透析缓冲液 | 可选 | ||
| JEOL-1400 透射电子显微镜（TEM） | 类似的 80 – 120 kV TEM，配备 Lab6 或钨灯丝，以及胶片和/或 CCD 相机（Gatan Orius SC1000 和/或 UltraScan1000 CCD 相机与 Gatan Digital Micrograph 软件包，或 Tietz 相机（TVIPS）） |
参考文献
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crysta....
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