评估电子晶体结构生物学研究的小膜蛋白的二维结晶试验

Summary

形成有序的膜蛋白质阵列的二维（2D）的结晶试验评价是一个非常关键的电子晶体而艰巨的任务。在这里，我们描述了我们的方法，筛选，并确定在15范围内的主要是小膜蛋白的二维晶体 - 90kDa。

Abstract

电子晶体学已经发展成为一个可以交替使用，也可以结合三维结晶和X射线晶体学研究膜蛋白的结构与功能的问题，以及可溶性蛋白的方法。二维（2D）晶体透射电子显微镜（EM）的筛查是在寻找关键的一步，优化，并选择冷冻电镜的高分辨率数据采集的样品。在这里，我们描述了大型和排序，以及小型二维数组，可以潜在的结晶条件的优化提供重要的信息在确定的基本步骤。

通过不同放大倍数的EM，在一系列关键参数的获取数据。下放大倍率上的形态和膜大小提供了宝贵的数据。在更高的放大倍率，确定可能的秩序和二维晶体的尺寸。在这种情况下，它是描述CCD相机和在线傅立叶变换是如何在更高的放大倍率用于评估顺序和大小proteoliposomes。

虽然膜蛋白的二维晶体，​​是最常用的透析重建的速度增长，筛选技术也同样适用于单层，帮助本地的二维晶体生产晶体，并下令可溶性蛋白质阵列。此外，这里介绍的方法适用于二维晶体更小，以及较大的膜蛋白，其中较小的蛋白质需要在识别相同数量的护理我们的例子中，较大的蛋白质晶格的筛选，可能会更容易识别在早期阶段的筛选。

Protocol

1。电网制备二维结晶试验

1. 碳包400目铜EM电网负染色准备。醋酸铀是经常使用的，并提供在存储解决方案方面的长期染色前使用，以及适合长期存储网格的几个月。相比之下，其他负面的污渍，如铀酸盐，同时提供优良的染色，需要新鲜的。对于大量的二维结晶试验筛选用于电网的快速准备，负染的修改后的版本使用。 2μL的样品量吸管将碳覆盖EM网格和孵育60秒。这是一个撕成片的Whatman＃4滤纸（图1，视频）从边缘杂交，然后2μL1％醋酸铀立即应用，这是再次涂抹后，30日从电网的边缘第在谈到与滤纸撕边的边缘电​​网确保不拆除的proteoliposomes最佳去除液体。此外，在电网的边缘干燥，确保改进的碳薄膜的保存。必须小心，在准备和处理电网，微妙的碳薄膜的破损防止样品的附着力，并可能导致不准确的代表性样品。虽然较大的样本量5μL传统和常规电网准备，可节省宝贵的样品量减少2μL或更少^2。
2. 为了产生尽可能大的膜，我们的一些样品需要透析缓冲甘油或蔗糖浓度高（10-20％）。这可能对电网准备的负面影响，如甘油或蔗糖是高度粘性和正确地渗透到缓冲区，因而不完全染色膜，防止醋酸铀。因此，一个可能的晶格会被遮蔽。可以通过离心的样品和替代甘油/蔗糖缓冲液（未显示），或电网交换缓冲区要么可水洗负染色类似与前几个周期的缓冲区或甘油/蔗糖在一个无缓冲^3,4冷冻电镜采用的技术。

2。评估EM二维结晶试验

1. 根....

Discussion

样品进行适当的评价，需要认真评估的足够数量的膜。例如，低至2％的晶体阵列成像proteoliposomes超过180的样品给了二维结晶条件的快速优化的关键信息。

蛋白质沉淀发生时，一个网格可能被放弃进一步的筛选后，在低倍率的检查，虽然偶尔出现部分沉淀的蛋白质。即使很小小于100 nm的膜虽然可以给有关订单的有用信息，并增加二维晶体大小的参数，可以在以下透析实验实施。

实验室在筛选^8,9的过程中引入不同程度的有前途的自动化过程。然而，样品将仍然需要评价和知识的二维晶体的大小，形态和秩序的步骤。在未来的日子里，它可能会变得越来越小的二维晶体分析数据，以更高的分辨率，使得这些筛选步骤，更小，更关键的结晶领域更困难的评价。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
			400 目铜 TEM 网格
：常规和抗毛细管			Dumont #5 和 Dumont N5AC 或类似移液器
吸头
Whatman #4 滤纸
1% 乙酸
要筛选 2D 的透析样品
不含甘油/蔗糖的透析缓冲液			可选的
JEOL-1400 透射电子显微镜 （TEM）			类似 80 –配备 Lab6 或钨丝和胶片和/或 CCD 相机（Gatan Orius SC1000 和/或 UltraScan1000 CCD 相机和 Gatan 数字显微照片软件包或 Tietz 相机 （TVIPS）） 的 120kV TEM）