乳腺上皮移植操作步骤

摘要

本文展示了 DeOme KB 等（1959 年）建立的方法以及 Brill B 等（2008 年）改进的方法，用于清除青春期小鼠第四腹股沟乳腺脂肪垫，以为移植乳腺组织片段、乳腺上皮细胞或乳腺肿瘤细胞做准备。

摘要

本文描述并比较了由DeOme KB开发的脂肪垫清除术 等¹ 以及 Brill B 开发的保留性手术程序 等²，随后进行乳腺上皮移植操作。乳腺移植技术被乳腺生物学家广泛采用，其原理在于乳腺上皮的显著发育直到青春期后才开始。在3周龄时，乳腺上皮树的生长局限于乳头周围区域，脂肪垫中大部分区域尚无乳腺上皮分布；而到7周龄时，上皮导管树已延伸至整个脂肪垫。因此，若在3周龄时切除含有上皮的脂肪垫小部分区域（即乳头与淋巴结之间的区域），内源性上皮将无法占据乳腺脂肪垫，此时该脂肪垫被称为“清除”状态。在此基础上，可将来自其他来源的乳腺上皮移植至已清除的脂肪垫中，使其具备在脂肪垫内重新建立并延伸乳腺导管树的潜力。该技术已被应用于多种实验模型中，包括在不受到动物整体基因型干扰的情况下，研究转基因乳腺上皮组织中肿瘤表型的表达。³通过有限稀释法移植细胞鉴定乳腺干细胞^4,5，确定增生性结节是否会发展为乳腺肿瘤⁶，并评估先前激素暴露对乳腺上皮细胞行为的影响^7,8.

将三周龄的宿主小鼠麻醉、消毒并固定在手术台上。从耻骨到胸骨沿正中矢状位在皮肤上做一纵行切口，但不切开腹膜。从正中矢状切口处沿骨盆向两侧后肢方向做斜向切口。将皮肤从腹膜上分离，暴露第4对腹股沟乳腺。通过去除淋巴结前方的脂肪垫组织清除脂肪垫。将上皮组织碎片或上皮细胞移植至清理后的剩余脂肪垫中，然后缝合小鼠切口。

方案

1. 移植上皮的制备

新鲜或冷冻的供体上皮组织均可移植到已清除的脂肪垫中，但预先处理的冷冻供体上皮组织更为方便，且移植效率仅轻微降低（>85% 的效率）。冷冻供体上皮组织的制备方案如下：

在制备受体移植上皮之前，先准备好上皮细胞的冻存液，并将约1 ml分装至冻存管中。冻存液可在4°C保存长达6个月，直至使用。冻存液包含用HEPES和NaHCO₃缓冲的DMEM/F12培养基、10%胎牛血清（FBS）以及10%二甲基亚砜（DMSO）。

从刚处死的雌性小鼠中收获乳腺上皮组织。

1. 用70%乙醇擦拭小鼠。
2. 从耻骨到胸骨沿身体前壁做一正中矢状切口，注意不要刺破腹腔的浆膜。从耻骨处的初始切口向后肢两侧分别做斜向切口（图1）。
3. 剥离体壁以分离浆膜，暴露5^th 附着于体壁腹侧筋膜上的腹股沟乳腺。实现该分离的最佳方法是用弯头镊子的弯曲部分小心夹住浆膜，注意避免刺穿腹侧体腔。同时，用直齿镊夹住皮肤切缘，将体壁从浆膜上拉开。
4. 在乳腺中识别淋巴结。淋巴结位于乳腺内三条明显血管的交汇处，可在脂肪垫中触摸到一个致密的结节（图2）。用眼科剪的尖端剪除淋巴结周围脂肪组织。用食指从皮肤表皮侧施加压力，使淋巴结从脂肪垫中隆起，再用弯头镊将其夹除。弃去淋巴结。
5. 用弯头镊的弯曲边缘夹住乳腺脂肪垫，同时固定皮肤边缘，逐渐将脂肪垫从体壁剥离。沿脂肪垫走向背侧表面的方向，完整地将整个乳腺组织一次性取出。
6. 将乳腺置于无菌的塑料切块板上。加入少量培养基，约200 μl，置于腺体表面以保持湿润。使用新的剃须刀片将腺体切成约1 mm的碎块。用镊子将切碎的腺体均分为四份，分别放入含有冷冻保存液的四个冻存管中。将冻存管放入Nalgene“Mr. Frosty”细胞冻存盒中，该冻存盒外槽内装有250 ml异丙醇。将Nalgene冻存盒置于-70℃°在C冻存盒中冷冻24小时。将含有乳腺组织片段的冻存管储存于液氮中，待移植时取出使用。每支冻存管所含乳腺组织片段足以移植至4至8只受体小鼠的去脂肪垫中。

2. 移植细胞的制备

本实验室已将多种细胞类型移植到小鼠清除脂肪垫中，包括永生化乳腺上皮细胞系、乳腺肿瘤细胞系或原代乳腺细胞。Comma-D 细胞移植前的制备方案如下：

1. Comma-D 细胞在含有 DMEM:F12 的常规 MECL 培养基中培养，该培养基添加 2% 成年牛血清（ABS）、mEGF、胰岛素和抗生素/抗真菌剂（AB/AM）。
2. 当细胞融合度达到 85%–90% 时，收集 Comma-D 细胞。
3. 将细胞悬液在 1200 rpm 条件下离心 5 分钟以收集细胞。用新鲜 MECL 培养基重悬细胞，并将细胞浓度调整至 5 × 10⁶/ml。

对于原代乳腺细胞的移植，需从 小鼠 5 中分离原代乳腺上皮细胞^th 通过机械和酶解离方法分离乳腺组织中的乳腺细胞。细胞重悬于DMEM:F12培养基中，并调整至所需浓度，通常为5 x 10⁶/ml

3. 清除小鼠乳腺脂肪垫的标准操作流程

1. 麻醉三周龄的宿主小鼠。选择体重相近且健康状况良好的小鼠。 <12 克，以确保乳腺导管生长尚未启动。我们使用每公斤体重 200 毫克的 2,2,2-三溴乙醇。
2. 小鼠麻醉后，将其牢固地仰卧固定在手术台上，四肢伸展，使腹部绷紧。术前给予镇痛剂，可使用布比卡因（bupivacaine）<1 mg/kg）或丁丙诺啡（0.05 mg/kg），皮下注射。
3. 用镊子夹住骨盆上方几毫米处的皮肤，并将其从腹部提起。用剪刀剪开皮肤，沿正中矢状面切开体壁，切口从耻骨延伸至胸骨。注意不要刺破腹腔的浆膜。初始切口勿过于靠近尿道，以免伤口夹影响小鼠排尿功能。
4. 从初始切口开始，沿中线向骨盆两侧分别朝后肢方向做斜向皮肤切口。
5. 使用弯头镊子的弯曲部分轻轻夹住浆膜。用组织镊夹住皮肤切缘，将腹壁从浆膜上拉开，暴露第5节^th 位于体壁腹侧筋膜上的腹股沟乳腺。
6. 灼烧乳头、淋巴结及通向淋巴结的两条动脉（图2）
7. 分离第四和第五腺体。烧灼第五腺体边缘，以防止第六腺体组织长入。^th 腺体
8. 用剪刀在淋巴结腹侧（朝向乳头的一侧）横切第四乳腺脂肪垫，将其分离。使用弯头镊子牢固夹住脂肪垫的腹侧部分，并将其完整地从腹壁上剥离。将脂肪垫的腹侧部分夹在两张载玻片之间，放入盛有卡诺固定液的玻璃组织染色皿中。该组织后续将用卡明铝溶液固定并染色，以检查切缘是否干净（图3）。用弯头镊子清理已切除脂肪垫区域周围的筋膜，彻底清除残留的乳腺组织。

4. 清除脂肪垫的替代“保留”术式

在熟练掌握清除小鼠乳腺脂肪垫的标准操作后，研究者可能更倾向于尝试Brill et al.（2008）²所建立的创伤更小的保留式手术方法。

1. 按照标准操作步骤准备小鼠。
2. 捏住第四对腹股沟乳腺的乳头，用剪刀尖在乳头周围剪出一个直径3-5 mm的环形切口。
3. 将乳头从身体上拉开，分离已切割的皮肤部分，并通过切口取出第四对腹股沟乳腺。
4. 识别该淋巴结。使用电灼器对淋巴结及其周围进行电灼处理^th 通过孔洞将乳腺组织取出。
5. 切下并分离最表层的5^th 乳腺组织在靠近淋巴结前切除，将乳头、环形皮肤区域及含有上皮组织的乳腺脂肪垫整块切除。

5. 组织/细胞移植

1. 移植上皮组织片段时，将上皮组织的冻存管解冻，并将上皮片段转移至含有新鲜培养基的培养皿中，以稀释DMSO。用剪刀尖在去脂肪垫中制作一个小孔或口袋，用于植入新的上皮组织。用针状镊子将一块1 mm大小的供体上皮组织放入该口袋中。撤出针状镊子时，用组织镊子夹住口袋使其闭合，以确保组织保留在原位。
2. 移植细胞时，使用50 μl Hamilton注射器配合22s规格针头，将50,000个细胞悬浮于10 μl培养基中，注射至每个脂肪垫内。

6. 小鼠的关闭/复苏

1. 整理皮肤以进行闭合。用镊子夹住对侧的皮肤边缘，将它们合拢并提起，使其远离腹腔的浆膜，然后用伤口夹闭合。通常情况下，标准操作需要使用两个伤口夹闭合正中矢状切口，每个斜切口各使用一个伤口夹。注意避免阻塞尿道。在正中矢状切口与斜切口交汇处的皮肤间隙，可能需要用缝线进行缝合闭合。简化操作仅需在每侧使用一个伤口夹。
2. 将小鼠放回笼中，并将笼子置于加热灯下，直至小鼠苏醒。
3. 伤口夹应在术后两周后拆除。

图1. 切口模式示意图。

图2. 淋巴结、血管、乳头及内源性上皮的位置。在所示位置进行烧灼。

图3. 整体染色显示内源性上皮仅局限于圆圈内的区域，因此边缘为“清晰”。

7. 代表性结果

图4. 3周龄小鼠去除的脂肪垫整体装片，显示边缘已清除。

图5. 来自一只10周龄小鼠的完整组织标本，显示脂肪垫中内源性乳腺上皮已被清除。

图6. 10周龄小鼠透明化脂肪垫的苏木精和伊红染色切片。

图7. 来自一只10周龄小鼠的完整组织标本，显示由移植的上皮组织发育而成的正常乳腺导管树。

图8. 移植上皮发育出的乳腺导管的苏木精和伊红染色切片。

图9. 移植上皮组织发展出的乳腺肿瘤的苏木精和伊红染色切片。

讨论

在本报告中，我们介绍了两种用于清除小鼠乳腺脂肪垫以准备乳腺上皮移植的替代方法。自1959年DeOme 等¹建立以来，标准方法一直被沿用。尽管标准方法更具侵入性，但由于能够清晰观察乳腺组织的结构与方向，因此更适合初学者培训。然而，经验丰富的外科操作者可能更倾向于采用保留性手术方法，因其具有多项优势²。最重要的是，保留性手术侵入性更小、耗时更短，且仅需短暂吸入麻醉即可完成，从而缩短了小鼠的恢复时间。此外，该方法还可应用于更年轻的动物（<21天），并能有效清除上皮组织。同时，术后组织粘连减少，若实验需要重复手术切除原发肿瘤并持续长期观察小鼠转移情况，则此优势尤为显著。

该手术的移植部分利用了乳腺完全发育直到青春期后才发生的特性。通过预先切除含有内源性上皮的小部分脂肪垫，可“清除”幼鼠剩余的脂肪垫，从而消除内源性上皮导管树发育的可能性。实验用上皮组织可被移植至受体鼠已清除的脂肪垫中，随后对所形成的外生长结构进行评估，且不会受到内源性宿主上皮的干扰。因此，该方法适用于评估乳腺上皮细胞的发育能力 体内.