从大鼠股骨和胫骨中分离出MSCs，并通过磁性细胞分选进行富集。通过流式细胞术确认分选细胞表面标志物的表达。这些细胞还在克隆密度下培养以形成单个克隆，然后使用克隆环分离这些克隆。
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摘要
摘要
间充质干细胞（MSCs）是一类成体干细胞，具有广阔的治疗应用前景。这些细胞可从骨髓中分离获得，并因其具有贴壁生长特性，可轻松与造血干细胞（HSCs）分离。本实验方案描述了如何从大鼠股骨和胫骨中分离MSCs。分离后的细胞进一步通过磁性细胞分选法，利用两种MSC表面标志物CD54和CD90进行富集。随后通过流式细胞术分析验证CD54和CD90表面标志物的表达。同时检测造血干细胞标志物CD45，以确认分选后的MSCs中是否已去除HSCs。MSCs在自然状态下具有较高的异质性，其中存在多种亚群，这些亚群在形态、增殖能力及分化潜能方面各不相同。这些亚群均表达已知的MSC标志物，但目前尚未发现可用于区分不同亚群的特异性标志物。因此，分离不同亚群的替代方法是使用克隆环分离单克隆来源的细胞。来源于单个克隆的细胞可分别进行培养和评估。
方案
1. 大鼠MSCs的分离
间充质干细胞取自6至8周龄的Sprague-Dawley雌性大鼠，分离方法如前所述1, 2。分离得到的MSCs可贴附于塑料表面，并在体外培养中易于扩增。
- 将动物放入麻醉室中，麻醉约五分钟。在麻醉过程中，观察其眨眼频率、呼吸频率和运动活动。一旦动物停止运动活动且眨眼频率变得稀少，立即将其从麻醉室中取出。
- 将动物仰卧于手术台上，通过颈椎脱位法处死。剪下后肢的股骨和胫骨，去除皮肤和肌肉。
- 将分离出的股骨和胫骨浸入70%异丙醇中数秒，随后转移至1× D-PBS中。
- 在生物安全柜中，将股骨和胫骨转移至含有DMEM的10 cm培养皿中。用镊子夹住每根骨骼，用剪刀剪开两端。在3 ml注射器上安装22G针头，并吸入DMEM，将针头插入骨骼的一端开口，冲洗骨髓至50 ml离心管中。每根骨骼重复冲洗2~3次。待所有骨髓收集完毕后，重悬细胞，并将细胞悬液通过70 μm细胞筛网，以去除骨碎片和血细胞聚集体。
- 在200 ×g、4°C条件下离心5分钟，吸弃上清液。将细胞重悬于25 ml MSC培养基（含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM）中。将10 ml细胞悬液接种至每个10 cm培养皿中，共接种两个培养皿。将培养皿置于37°C、5% CO2的培养箱中培养1~2周，每2~3天更换一次培养基。
2. 大鼠MSCs的富集
已有多种表面蛋白被用于富集间充质干细胞（MSCs），包括CD54、CD90、CD73、CD105和CD2713-5。在本研究中，我们采用CD54和CD90作为标志物，通过磁性细胞分选技术富集间充质干细胞。
- 当细胞生长至约80%融合度时，吸除培养基，每皿加入4~5 ml胰蛋白酶-EDTA溶液。将培养皿放回培养箱，孵育约5分钟，使细胞脱落。细胞脱落后，加入等体积的完全培养基以中和胰蛋白酶活性。将细胞悬液收集至15 ml离心管中，在200g、4°C条件下离心5分钟，沉淀细胞。
- 以下步骤描述如何根据BD IMagnet细胞分离试剂盒说明书，利用两种表面标志物CD54和CD90富集间充质干细胞（MSCs）。将细胞沉淀重悬于细胞染色缓冲液（含3%热灭活FBS的1×D-PBS）中，浓度为2000万个细胞/ml。加入生物素标记的抗CD54抗体（每百万细胞0.25 μg）和生物素标记的抗CD90抗体（每百万细胞0.15 μg），轻轻混匀。冰上孵育15分钟后，用过量的1× BD IMag缓冲液洗涤标记后的细胞。在200g、4°C条件下离心5分钟，沉淀细胞。
- 充分涡旋混匀BD IMag链霉亲和素磁珠，每1000万个细胞加入40 μl磁珠。将磁珠与标记后的细胞充分混合，并在6~12°C条件下孵育30分钟。此步骤使链霉亲和素磁珠结合至已与细胞表面蛋白CD54和CD90分别结合的生物素化抗CD54和抗CD90抗体上。
- 在孵育期间，标记一个圆底试管用于收集阳性组分。孵育结束后，用1× BD IMag缓冲液将体积调整至细胞浓度为2000万个细胞/ml，并将标记后的细胞转移至用于收集阳性组分的试管中。将该试管置于BD IMagnet磁力架上，静置6分钟，然后在试管仍置于磁力架上的情况下，用玻璃巴斯德吸管小心移除上清液。
- 从BD IMagnet磁力架上取下阳性组分试管，置于冰上。加入1 ml预冷的1× BD IMag缓冲液，轻轻混匀重悬细胞。将试管重新放回BD IMagnet磁力架上，静置2~4分钟。用新的玻璃巴斯德吸管移除上清液。重复上述洗涤步骤一次。
- 从BD IMagnet磁力架上取下试管，将细胞重悬于完全培养基中，接种至一个75 cm2培养瓶用于细胞维持培养，另接种一个10 cm培养皿用于流式细胞术分析。
3. 通过流式细胞术验证表面标志物表达
通过流式细胞术分析验证所获得的细胞表达CD54和CD90。利用造血干细胞（HSC）标志物CD45确认间充质干细胞（MSCs）中已去除HSCs。
- 当细胞融合度达到约80%时，使用胰蛋白酶-EDTA消化细胞，并将细胞收集至15 ml离心管中。在4°C下以200g离心5分钟，收集细胞。
- 吸除上清液，用1× D-PBS洗涤细胞一次。将细胞重悬于细胞染色缓冲液（含2% FBS和0.05%叠氮化钠的1× D-PBS）中，调整细胞浓度至500万~1000万个细胞/ml，并将细胞置于冰上保存。取100 μl细胞悬液分装至六个已标记的离心管中（1. 仅细胞；2. 同型对照IgG2a；3. 同型对照IgG1；4. CD45；5. CD54；6. CD90）。
- 加入适当浓度的同型对照抗体和一抗（IgG2a和IgG1：每百万个细胞20 μl；CD45：每百万个细胞0.5 μg；CD54：每百万个细胞0.25 μg；CD90：每百万个细胞0.15 μg），在4°C孵育30分钟。
- 用1× D-PBS洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于100 μl细胞染色缓冲液中。加入SA-PE（链霉亲和素-藻红蛋白，每百万个细胞使用0.15 μg），避光并在4°C孵育30分钟。
- 用1× D-PBS将标记后的细胞洗涤两次。将细胞重悬于400 μl细胞染色缓冲液中，转移至流式管中，用于流式细胞术分析。
4. 单克隆来源的间充质干细胞的分离
间充质干细胞（MSCs）是一类异质性细胞群体，由具有不同细胞形态、增殖速率以及分化能力的亚群组成6。然而，所有这些亚群均表达已知的MSC标志物，因此无法利用标志物来分离这些亚群。为此，我们采用克隆环法分离由单个细胞形成的克隆集落，从而获得不同的亚群。
- 将细胞以每10 cm培养皿约50~100个细胞的密度接种，在37°C、5% CO2的培养箱中培养1~2周。在此期间，使用倒置显微镜观察分离良好的单个克隆。当克隆生长至足够大小（建议每个克隆细胞数超过100个）时，用记号笔在培养皿底部标记克隆位置。选择标记克隆时，应确保所选克隆周围无其他邻近克隆。
- 吸除培养基，用1× D-PBS洗涤培养皿一次。用无菌镊子夹取无菌克隆环，轻轻放置于已标记的克隆周围。重复此操作，直至所有待选克隆均被克隆环包围。所选克隆之间应保持足够距离，确保每个克隆环内仅包含一个克隆。
- 向每个克隆环内加入100 μl胰蛋白酶-EDTA溶液，将培养皿放回培养箱中孵育约5分钟。5分钟后，在显微镜下观察细胞是否变圆。当细胞开始脱落时，加入等体积的完全培养基以中和胰蛋白酶活性。用200 μl移液器轻轻吹打混匀细胞悬液，并将细胞悬液转移至含有3 ml预温培养基的60 mm培养皿中。正确标记培养皿后放回培养箱继续培养，并在接下来的几天内追踪细胞形态变化。
5. 代表性结果
根据大鼠MSCs分离部分所述的实验方案，接种后次日应可见贴壁生长的MSCs。随着细胞持续增殖，汇合的细胞应呈现如图1A所示的形态。当细胞达到约80%汇合度时（图1B），可进行传代培养。传代过程中，使用胰蛋白酶-EDTA消化使细胞脱落，脱落的细胞体积较小且呈圆形，如图1C所示。
图 1. 大鼠间充质干细胞的相差显微图像。（A）融合的间充质干细胞，大多数细胞呈纺锤形或星形。（B）约 80% 融合度的间充质干细胞。（C）胰蛋白酶消化后脱落的细胞体积较小且呈圆形。
通过磁性细胞分选富集间充质干细胞（MSCs）后，采用流式细胞术分析以验证其表面标志物的表达情况。若富集效果良好，细胞应对MSC标志物CD54和CD90呈阳性染色，而对造血干细胞（HSC）标志物CD45呈阴性染色（图2）。同型对照IgG2a和IgG1用作阴性对照。
图2. 间充质干细胞表面标志物的流式细胞术分析。 间充质干细胞使用抗IgG2a（同型对照1）、IgG1（同型对照2）、CD45、CD54和CD90抗体进行标记。间充质干细胞表达CD54和CD90，但不表达CD45。
当细胞以适当的单克隆密度接种时，菌落应由单个细胞形成。图3A展示了一个由单个细胞形成的菌落。随后可使用克隆环分离这些菌落，并将来自不同菌落的细胞分别进行培养。图3B和图3C分别代表来自两个独立菌落的细胞。来自菌落1的细胞呈纺锤形（图3B），而来自菌落2的细胞呈圆形（图3C）。
图3. 间充质干细胞及其单克隆来源细胞的集落形成。 在克隆密度下培养的间充质干细胞（MSCs）可形成独立的细胞集落。这些集落可通过克隆环分离，并可将来自不同集落的细胞分别进行培养。（A）间充质干细胞在克隆密度接种后形成的代表性集落。（B）来自一个集落的纺锤形细胞。（C）来自另一个集落的圆形细胞。
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讨论
本方案描述了如何分离和富集间充质干细胞（MSCs），并包含一种分离单克隆来源细胞的方法。成功的分离、富集及克隆分离涉及多个关键步骤。从大鼠中进行细胞分离时，建议通过细胞筛网或类似孔径的无菌尼龙膜过滤，以去除血凝块和骨碎片。细胞接种过夜后，培养基中会漂浮大量死亡细胞，此时更换新鲜培养基可去除死细胞，从而促进贴壁细胞的生长。
本方案中的磁性细胞分选技术描述了如何进行阳性筛选，类似的操作流程也可用于进行阴性筛选。抗体的添加量可能有所不同，需进行优化以获得更佳的分选效果。细胞标记用于流式细胞术分析时同样需要优化。若标记后的样本不能立即进行流式细胞术分析，可用2%甲醛固定后延迟检测。然而，不建议长期保存样本，因为这往往会导致自发荧光增强，从而降低样本质量。
菌落分离的关键在于以合适的细胞密度进行接种（需通过实验优化确定）以及挑选周围无其他克隆的单个克隆。如果附近存在其他克隆，克隆环可能会覆盖邻近的克隆，导致所获得的细胞不再来源于单一克隆。将克隆环放置于克隆上方时，注意不要在培养皿表面滑动，否则克隆环底部的硅脂会覆盖细胞，阻碍胰蛋白酶...
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致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院（R01GM079688、R21RR024439 和 R21GM075838）、美国国家科学基金会（CBET 0941055）以及密歇根州立大学基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| 细胞筛 | BD Biosciences | 352350 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| 生物素标记小鼠IgG2a | BD Biosciences | 555572 | |
| 生物素标记小鼠IgG1 | BD Biosciences | 555747 | |
| 生物素标记抗大鼠CD54抗体 | Cedarlane Labs | CL054B | |
| 生物素标记抗大鼠CD90抗体 | Cedarlane Labs | CL005B | |
| 生物素标记抗大鼠CD45抗体 | Cedarlane Labs | CL001B | |
| BD Imag缓冲液 | BD Biosciences | 552362 | |
| 圆底管 | BD Biosciences | 352063 | |
| 链霉亲和素磁珠 | BD Biosciences | 557812 | |
| SA-PE | R&D Systems | F0040 | |
| 克隆环 | Sigma-Aldrich | C2059 |
参考文献
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells. J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
- Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. Krause Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102, 3483-3493 (2003).
- Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).
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重印与许可
