在甲醇酵母 Pichia pastoris 中表达重组蛋白

摘要

本方案描述了利用甲醇酵母Pichia pastoris进行蛋白表达的方法。同时包括电转感受态酵母细胞的制备、将含有目的基因的载体转化至P. pastoris以及酵母DNA的纯化。最后步骤包括蛋白质的Western印迹分析和蛋白纯化。

摘要

在微生物真核宿主Pichia pastoris中进行蛋白表达，可在一种快速且易于使用的表达系统中大量生产重组蛋白。

作为一种单细胞微生物，P. pastoris 易于操作，可在廉价培养基上以高细胞密度快速生长。作为真核生物，P. pastoris 能够执行许多高等真核细胞所进行的翻译后修饰，所获得的重组蛋白可发生蛋白质折叠、蛋白水解加工、二硫键形成以及糖基化[1]。

作为一种甲基营养型酵母，P. pastoris 能够以甲醇作为唯一碳源进行代谢。醇氧化酶基因 AOX1 的强启动子受到严格调控，并可被甲醇诱导，常用于目的基因的表达。因此，通过向培养基中添加甲醇即可诱导外源蛋白的表达[2; 3]。

另一个重要优势是利用信号序列将外源蛋白靶向巴斯德毕赤酵母（P. pastoris）的分泌途径，从而实现重组蛋白向培养基中的分泌。由于酵母自身向培养基分泌的内源性蛋白水平极低，且培养基中无外源添加蛋白，因此异源蛋白在培养基总蛋白中占主导地位，有利于后续的蛋白纯化步骤[3; 4]。

此处使用的载体（pPICZαA）包含AOX1启动子，可用于严格调控并在甲醇诱导下表达目的基因；含有α因子分泌信号，以实现重组蛋白的分泌；含有Zeocin抗性基因，可用于在E. coli和Pichia中进行筛选；以及一个C端肽段，该肽段包含c-myc表位和多聚组氨酸（6xHis）标签，用于重组蛋白的检测与纯化。我们还展示了利用特异性Anti-myc-HRP抗体对重组蛋白进行的Western印迹分析，该抗体可识别原始载体上的c-myc表位。

方案

在甲醇酵母Pichia pastoris中表达重组蛋白

在开始本实验方案之前，您应已将目标基因正确地克隆至P. pastoris 空载载体中，并对载体进行测序，以确认目标基因已正确插入。

第一步：制备电转感受态酵母细胞、质粒线性化及转化至 P. pastoris

进行此步骤时，您需要准备好以下培养基和培养板：

• YPDS 平板
• 600 mL YPD 培养基
• 预冷的无菌水
• 1 M 山梨醇
• Amicon Ultra-4 离心过滤装置
• Microcon YM-30 离心过滤单元
• 0.2 cm 电穿孔比色皿
• 15 mL 无菌玻璃试管
• 无菌玻璃巴斯德吸管
• 含 Zeocin 的 YPDS 平板

第1部分：电转感受态酵母细胞的制备

1. 在计划进行转化的四天前，将 P. pastoris 细胞划线接种于不含 Zeocin 的 YPDS 平板上，并在 30°C 下培养 1–2 天，直至形成单菌落。
2. 在计划进行转化的两天前，将 5 ml 的 P. pastoris 菌株接种于 50 ml 离心管中的 YPD 培养基中，在 30°C 下过夜培养。将离心管放入三角烧瓶中固定，置于摇床中培养。
3. 转化前一天，用 0.25 ml 过夜培养物接种 2 升三角烧瓶中的 500 ml 新鲜 YPD 培养基，并在 30°C 摇床中继续过夜培养，使菌液 OD₆₀₀ 达到 1.3–1.5。
   注意：在分光光度计上测量前需稀释样品，以获得准确结果。
4. 转化当天，准备好冰上预冷的无菌水和 1 M 山梨醇溶液。在 4°C 下以 1500 × g 离心 5 分钟收集细胞，然后用 500 ml 冰上预冷的无菌水重悬沉淀。
5. 再次按照步骤 4 的条件离心细胞，然后用 250 ml 冰上预冷的无菌水重悬沉淀。
6. 再次按照步骤 4 的条件离心细胞，然后用 20 ml 冰上预冷的 1 M 山梨醇溶液重悬沉淀。
7. 再次按照步骤 4 的条件离心细胞，然后用 1 ml 冰上预冷的 1 M 山梨醇溶液重悬沉淀，终体积约为 1.5 ml。将细胞悬液置于冰上或 4°C 保存，待后续使用。
   注意：我们制备的电转感受态细胞通常多于实际所需量，并分装为每管 80 μl 存放于微量离心管中，于 -80 °C 保存。储存的细胞在一个月内使用完毕。

第2部分：pPICZαA 载体的线性化与浓缩

为了进行转化，通过限制性酶切将含有目的基因的载体线性化。我们使用 PmeI 酶，也可使用其他限制性酶切位点。必须确保插入片段中不含有用于载体线性化的限制性酶切位点。将 DNA 线性化后，用于转化入 P. pastoris 的量为 5–20 μg，溶于 5–10 μl 无菌水中。

同时将无插入片段的普通载体线性化、浓缩，并转入P. pastoris中。不含插入片段的原始载体可作为细胞内本底表达的对照，有助于您解读表达结果。

1. 将所有试剂在冰上解冻，混合以下试剂，并短暂离心使液体全部沉至管底，轻弹管壁后再次离心：
   • x μl 无菌水
   • 5.0 μl 10X NEBuffer 4
   • 0.5 μl 100X BSA
   • 最多 2 μg 载体 DNA（约 100 ng/μl）
   • 2.0 μl PmeI 酶混合液
   → 总反应体积为 50 μl
   注意：为获得足量的线性化载体 DNA，建议在多个独立的离心管中分别配制上述反应体系 3 至 4 份，在使用 Amicon Ultra 离心浓缩装置浓缩消化后的 DNA 时再将各管溶液合并。
2. 在 37°C 下孵育 3 小时，随后在 65°C 下加热 20 分钟以灭活酶混合液。
3. 在此期间，用 1 mL Milli-Q  水预冲洗 Amicon Ultra-4 离心滤过装置，于 4000 × g 离心 6–8 分钟，弃去滤过液。
   注意：膜润湿后切勿使其干燥。若预冲洗后暂不使用该装置，请在膜上保留少量水，直至使用前再弃去。
4. 将第 2 步中热灭活后的反应液转移至已预冲洗的 Amicon 离心滤过装置中，于 4000 × g 离心 6–8 分钟，弃去滤过液。
   注意：若已制备多份线性化反应液，请将所有溶液合并至同一个 Amicon 离心滤过装置中。
5. 继续离心，直至 Amicon 滤膜上的溶液体积减少至约 100 ~ 150 μl。将上一步的空管中加入 1.5 mL 无菌水，混匀后转移至 Amicon 管中，重复离心步骤。再用 1.5 mL 无菌水洗涤一次，并再次弃去滤过液，最终将体积浓缩至约 150 μl。洗涤步骤可去除缓冲液中残留的盐分，防止电穿孔时发生电弧现象。
   注意：本步骤使用摆动转子离心机；只需将盖紧的 Amicon 离心滤过装置放入 50 mL Falcon 管中固定即可。即使经过长时间离心，Amicon 滤膜仍会保留约 50 μl 溶液。
6. 为进一步浓缩 DNA 样品，将 Amicon 滤过装置中剩余的 DNA 溶液转移至已预冲洗的 Microcon YM-30 离心滤过装置中，并用额外 50 μl 无菌水冲洗 Amicon 管以回收全部 DNA。在微量离心机中以 10,000 × g 离心 Microcon 离心滤过装置，直至滤膜表面仍轻微覆盖液体为止。若滤膜上液体量较少，每次仅短时间离心，并每隔一分钟检查一次。为回收 DNA 溶液，将滤过装置倒置放入新的微量离心管中，在第二次离心步骤中以 1000 × g 离心 3 分钟。最终体积不应超过 10–15 μl，否则 DNA 可能因浓度过低而影响转化效率。
   注意：切勿离心过久，避免滤膜完全干燥，以防样品损失。若膜已干燥，可在膜上加入 10–15 μl 无菌水，轻轻振荡 30 秒，然后按上述方法回收 DNA。

第3部分：通过电穿孔法将目的基因转化至P. pastoris

1. 含有目的片段的线性化且浓缩的 pPICZαA DNA 现已准备好用于转化电转感受态的 P. pastoris 细胞（参见步骤 I，第 2 部分）。在转化前约 15 分钟，准备好以下试剂和设备：取一个微量离心管加入 1 mL 冰上预冷的 1 M 山梨醇；将一个 0.2 cm 电穿孔杯置于冰上；标记一个无菌的 15 mL 玻璃试管，并准备好一支无菌玻璃巴斯德吸管。
2. 将步骤 I 第 2.7 部分中的 80 μl 细胞转移至预冷的 0.2 cm 电穿孔杯中。加入步骤 I 第 3.6 部分中获得的浓缩线性化 pPICZαA DNA 溶液，并通过在电穿孔杯中左右移动移液器吸头来混匀。
   注意：加入 DNA 时仅将移液器按至第一档。在将 DNA 与细胞混匀后，将移液器按至第二档，然后缓慢从电穿孔杯中取出。
3. 将含有细胞的电穿孔杯置于冰上孵育 5 分钟。
4. 用纸巾擦拭电穿孔杯外壁，然后根据所用电穿孔仪器制造商推荐的酵母（Saccharomyces cerevisiae）参数进行电击。
   注意：我们使用 Bio-Rad GenePulser，设置如下：
   • 充电电压 (V)：1500；
   • 电容 (μF)：25；
   • 电阻 (Ω)：200。
   使用 0.2 cm 电穿孔杯时，该程序产生的脉冲时长约 ~10 ms，电场强度约为 ~7500 V/cm。
5. 立即向电穿孔杯中加入 1 mL 冰冷的 1 M 山梨醇。使用无菌玻璃巴斯德吸管将杯内液体转移至无菌 15 mL 试管中。
6. 将试管在 30°C 下静置孵育 1.5 小时，不振荡。
7. 在四个标好记号、含有 100 μg/mL Zeocin 的 YPDS 平板上各加入 5–7 颗无菌玻璃珠。从 15 mL 玻璃试管中取 250 μl 电穿孔混合液涂布于每个平板上。水平轻摇平板使细胞均匀分布。让平板静置干燥 15 分钟，然后通过倒置平板去除琼脂表面的玻璃珠。
   注意：当使用 GS115 Pichia 菌株时，我们采用 100 μg/mL Zeocin 进行转化子筛选。若使用其他 Pichia 菌株，筛选条件可能有所不同。
8. 将平板倒置，在 30°C 下培养 2 至 3 天，直至菌落形成。用黑色塑料袋包裹平板，以防止光敏性的 Zeocin 降解。平板中抗生素浓度过低可能导致假阳性克隆的出现。
9. 菌落形成后，挑选 12 个菌落，并通过在含有 100 μg/mL Zeocin 的新鲜 YPDS 平板上划线分离的方式进行纯化。

第二步：蛋白表达于 Pichia pastoris

进行此步骤时，您需要准备好以下培养基、培养板和试剂：

• BMGY 培养基
• 甘油，已灭菌
• BMMY 培养基
• 甲醇，已灭菌
• EPICENTRE 酵母 DNA 纯化试剂盒

您还需要以下烧瓶：

• 250 mL 锥形瓶，已灭菌
• 1 L 带挡板锥形瓶，已灭菌
• 200 mL 烧杯，已灭菌

第1部分：Pichia pastoris中的蛋白质表达

以下所有步骤同样适用于转化后的对照载体（无插入片段）。

1. 从步骤 I 第 3.9 部分纯化的 Pichia 菌落中挑取单个菌落，接种于无菌 250 mL 锥形瓶中的 25 mL BMGY 培养基中。在 30°C 摇床培养箱（250–300 rpm）中培养，直至菌液 OD₆₀₀ 达到 2–6（约 16–18 小时）。
   注意：在分光光度计上测量前需稀释样品，以获得准确结果。此时细胞处于对数生长期。
2. 当细胞达到合适的 OD₆₀₀ 时，制备甘油保存液。将 25 mL 菌液中的 800 μL 转移至 2 mL Corning 冻存管中，加入 200 μL 无菌甘油。将甘油保存液冷冻后于 -80°C 保存。
3. 为进行酵母 DNA 纯化，将 25 mL 菌液中的 1.5 mL 转移至微量离心管中。在室温下以 1300 × g 离心 1 分钟收集细胞。这些细胞用于分析 Pichia 整合子，以确认目的基因是否已整合至 Pichia 基因组中（见步骤 II 第 2 部分）。将细胞沉淀在 4°C 保存，待进一步分析。
4. 将剩余的 25 mL 菌液转移至 50 mL Falcon 管中，在室温下以 3000 × g 离心 5 分钟收集细胞。弃去上清液，将离心管倒置于纸巾上以去除残留培养基。用 20 mL BMMY 重悬细胞沉淀，以去除残留的 BMGY 培养基，因为 BMGY 中的甘油可能抑制后续表达。再次在室温下以 3000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
5. 用 BMMY 培养基将细胞沉淀重悬至 OD₆₀₀ = 1.0（约 100–200 mL），以诱导表达，并将菌液转移至 1 L 带挡板的锥形瓶中。用 200 mL 烧杯盖住瓶口，放回培养箱中于 30°C 继续培养。
   注意：温度不得超过 30°C。若培养箱温度波动，建议设定为 28°C。充足的通气是甲醇诱导期间高效表达的重要参数（诱导表达时，培养液体积切勿超过总瓶体积的 > 10–30%）。我们强烈推荐使用带挡板的锥形瓶，因其可向培养基中引入更多氧气。
6. 每隔 24 小时加入无菌纯甲醇，使甲醇终浓度为 0.5%，以维持诱导表达。
7. 在诱导表达开始后的特定时间点，取 1 mL 菌液转移至 1.5 mL 微量离心管中。在室温下以 1300 × g 离心 2.5 分钟。将上清液转移至另一支 1.5 mL 微量离心管中。将上清液和细胞沉淀在 -80°C 保存，待进一步分析。通过分析不同时间点的样品，确定诱导后蛋白表达的最佳时间。
   注意：我们选择 6 小时、12 小时、24 小时、36 小时和 48 小时作为取样时间点。最长可继续培养至 4 天。不同表达蛋白的最佳时间点可能不同。
8. 通过考马斯亮蓝染色的 SDS-PAGE 和 Western 印迹分析上清液和细胞沉淀中的蛋白表达（本方案未描述具体操作）。

第二部分：酵母DNA纯化及PCR分析 Pichia 整合子

用于巴斯德毕赤酵母（Pichia）培养物在BMGY培养基中进行酵母DNA纯化步骤的所有试剂均包含在EPICENTRE公司的MasterPure酵母DNA纯化试剂盒中。
注意：该分析为附加步骤，用于检测目的基因是否已整合到巴斯德毕赤酵母（Pichia）基因组中。使用从BMGY培养物中取样的1.5 mL样品所获得的细胞沉淀（见步骤II，第1.3部分）进行分析。

按照Epicentre MasterPure酵母DNA纯化试剂盒说明书进行操作，并使用针对插入片段的特异性引物对酵母DNA进行PCR扩增。取3 μl PCR产物，在含有1 μl溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。在其中一个泳道中加入1 Kb⁺ DNA标准分子量标记，以判断插入片段的大小，并使用凝胶成像系统观察DNA条带。

可通过蛋白质印迹分析检测重组蛋白。可使用金属离子负载树脂进行His标签蛋白纯化（本方案中未描述该步骤）。

附录，配方列表

步骤一：

1. YPD培养基：
   制备600 mL YPD培养基（酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基），将5 g酵母提取物和12 g蛋白胨溶解于540 mL水中。在液体循环条件下高压灭菌20分钟。
   同时，准备70 mL 20%葡萄糖溶液，并在使用前过滤除菌。
   待高压灭菌后的溶液冷却至约60°C，加入60 mL过滤除菌的20%葡萄糖溶液。
2. YPDS（+ Zeocin）平板：
   制备500 mL YPDS + Zeocin琼脂培养基（含山梨醇的酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基），将5 g酵母提取物、91.1 g山梨醇和10 g蛋白胨溶解于450 mL水中。加入10 g琼脂和一个磁力搅拌子，在液体循环条件下高压灭菌20分钟。
   同时，准备60 mL 20%葡萄糖溶液，并在使用前过滤除菌。
   待高压灭菌后的溶液冷却至约60°C，加入50 mL过滤除菌的20%葡萄糖溶液。
   在添加抗生素之前，先倒几块不含Zeocin的YPDS平板。然后从100 mg/mL的储备液中加入500 μL Zeocin，使琼脂中的终浓度为100 μg/mL。加入抗生素后，在磁力搅拌器上搅拌，并继续搅拌约2分钟，以确保均匀混合。
   将培养基倒入培养皿中，并用黑色塑料膜覆盖。室温下静置过夜使其干燥。含Zeocin的YPD平板储存于4°C，保质期为一至两周。
   注意：使用黑色塑料膜覆盖是必要的，因为Zeocin对光敏感。

第二步：

1. BMGY（缓冲甘油复合培养基）和 BMMY（缓冲甲醇复合培养基）：
   将每种培养基的 8 g 酵母提取物和 16 g 蛋白胨溶解于 560 mL 水中。在液体循环条件下高压灭菌 20 分钟。
   同时配制以下溶液：
   • 1 M 磷酸钾缓冲液，pH 6.0：
   取 24 mL 1 M K₂HPO₄ 和 156 mL 1 M KH₂PO₄ 混合，并确认 pH = 6.0（若需调节 pH，使用磷酸或 KOH）。过滤除菌后室温保存。该溶液有效期超过一年。
   • 10X YNB（含硫酸铵、不含氨基酸的 13.4% 酵母氮源基础）：
   将 26.8 g 含硫酸铵、不含氨基酸的酵母氮源基础（YNB）溶解于 200 mL 水中，过滤除菌。加热溶液以使 YNB 完全溶解。4°C 保存。该溶液有效期约为一年。注意：也可使用 3.4 g 不含硫酸铵和氨基酸的 YNB，并额外加入 10 g 硫酸铵。
   • 500X B（0.02% 生物素）：
   将 10 mg 生物素溶解于 50 mL 水中，过滤除菌。4°C 保存。该溶液有效期约为一年。
   • 10X M（5% 甲醇）：
   将 5 mL 甲醇与 95 mL 水混合，过滤除菌，4°C 保存。该溶液有效期约为两个月。
   • 10X GY（10% 甘油）
   将 10 mL 甘油与 90 mL 水混合，过滤除菌。室温保存。该溶液有效期超过一年。
   待高压灭菌的溶液冷却至室温后，加入以下组分并充分混匀：
   • 80 mL 1 M 磷酸钾缓冲液，pH 6.0；
   • 80 mL 10X YNB
   • 0.16 mL 500X B
   • 80 mL 10X GY
   配制 BMMY 时，用 80 mL 10X M 替代 10X GY。
   培养基于 4°C 保存。该溶液有效期约为两个月。

代表性结果

图1. 该蛋白免疫印迹图像显示了表达24小时后的四种蛋白（标记为1605、0537、1228和1682）。免疫印迹所用抗体为c-myc-HRP抗体。第二泳道（标记为N）为阴性对照，加样内容为未表达重组蛋白的细胞上清液，这些细胞因转化了空载体（普通载体）而不表达目标蛋白。

讨论

利用甲基营养型酵母进行蛋白质表达 Pichia pastoris 作为一种宿主系统在本方案中进行了描述。该蛋白可根据所使用的克隆载体分泌至培养基中。重组蛋白的分泌可简化后续纯化步骤。然而，所示条件可能需要针对不同蛋白的表达进行优化，条件及表达时间的改变可能会提高蛋白表达水平。本方案所用载体具有以下特征： c-myc 表位以及针对该表位的抗体均可购得。这使得研究人员能够分析目前尚无可用抗体的蛋白质。亲本载体上的His标签特性可实现蛋白质在金属螯合树脂上的纯化，且已有针对该载体His标签区域的抗体可供使用。

如本实验方案所述，在Pichia pastoris中进行蛋白表达是一个多步骤的过程，需要周密的规划和准备。完成所有步骤需要两到三周的时间（不包括目的基因表达载体的克隆时间）。成功转化P. pastoris的基础在于使用具有高转化效率的感受态酵母细胞，以及能够整合到酵母基因组中的线性化表达载体。Western blot分析和His标签纯化可用于检测重组蛋白的表达水平，是完成本方案后需进一步进行的后续实验步骤。