方法文章

在甲醇酵母 Pichia pastoris 中表达重组蛋白

DOI:

10.3791/1862

2010年2月25日

本文内容

摘要

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了利用甲醇酵母Pichia pastoris进行蛋白表达的方法。同时包括电转感受态酵母细胞的制备、将含有目的基因的载体转化至P. pastoris以及酵母DNA的纯化。最后步骤包括蛋白质的Western印迹分析和蛋白纯化。

摘要

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在微生物真核宿主Pichia pastoris中进行蛋白表达,可在一种快速且易于使用的表达系统中大量生产重组蛋白。

作为一种单细胞微生物,P. pastoris 易于操作,可在廉价培养基上以高细胞密度快速生长。作为真核生物,P. pastoris 能够执行许多高等真核细胞所进行的翻译后修饰,所获得的重组蛋白可发生蛋白质折叠、蛋白水解加工、二硫键形成以及糖基化[1]。

作为一种甲基营养型酵母,P. pastoris 能够以甲醇作为唯一碳源进行代谢。醇氧化酶基因 AOX1 的强启动子受到严格调控,并可被甲醇诱导,常用于目的基因的表达。因此,通过向培养基中添加甲醇即可诱导外源蛋白的表达[2; 3]。

另一个重要优势是利用信号序列将外源蛋白靶向巴斯德毕赤酵母(P. pastoris)的分泌途径,从而实现重组蛋白向培养基中的分泌。由于酵母自身向培养基分泌的内源性蛋白水平极低,且培养基中无外源添加蛋白,因此异源蛋白在培养基总蛋白中占主导地位,有利于后续的蛋白纯化步骤[3; 4]。

此处使用的载体(pPICZαA)包含AOX1启动子,可用于严格调控并在甲醇诱导下表达目的基因;含有α因子分泌信号,以实现重组蛋白的分泌;含有Zeocin抗性基因,可用于在E. coliPichia中进行筛选;以及一个C端肽段,该肽段包含c-myc表位和多聚组氨酸(6xHis)标签,用于重组蛋白的检测与纯化。我们还展示了利用特异性Anti-myc-HRP抗体对重组蛋白进行的Western印迹分析,该抗体可识别原始载体上的c-myc表位。

方案

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在甲醇酵母Pichia pastoris中表达重组蛋白

在开始本实验方案之前,您应已将目标基因正确地克隆至P. pastoris 空载载体中,并对载体进行测序,以确认目标基因已正确插入。

第一步:制备电转感受态酵母细胞、质粒线性化及转化至 P. pastoris

进行此步骤时,您需要准备好以下培养基和培养板:

  • YPDS 平板
  • 600 mL YPD 培养基
  • 预冷的无菌水
  • 1 M 山梨醇
  • Amicon Ultra-4 离心过滤装置
  • Microcon YM-30 离心过滤单元
  • 0.2 cm 电穿孔比色皿
  • 15 mL 无菌玻璃试管
  • 无菌玻璃巴斯德吸管
  • 含 Zeocin 的 YPDS 平板

第1部分:电转感受态酵母细胞的制备

  1. 在计划进行转化的四天前,将 P. pastoris 细胞划线接种于不含 Zeocin 的 YPDS 平板上,并在 30°C 下培养 1–2 天,直至形成单菌落。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利用甲基营养型酵母进行蛋白质表达 Pichia pastoris 作为一种宿主系统在本方案中进行了描述。该蛋白可根据所使用的克隆载体分泌至培养基中。重组蛋白的分泌可简化后续纯化步骤。然而,所示条件可能需要针对不同蛋白的表达进行优化,条件及表达时间的改变可能会提高蛋白表达水平。本方案所用载体具有以下特征: c-myc 表位以及针对该表位的抗体均可购得。这使得研究人员能够分析目前尚无可用抗体的蛋白质。亲本载体上的His标签特性可实现蛋白质在金属螯合树脂上的纯化,且已有针对该载体His标签区域的抗体可供使用。

如本实验方案所述,在Pichia pastoris中进行蛋白表达是一个多步骤的过程,需要周密的规划和准备。完成所有步骤需要两到三周的时间(不包括目的基因表达载体的克隆时间)。成功转化P. pastoris的基础在于使用具有高转化效率的感受态酵母细胞,以及能够整合到酵母基因组中的线性化表达载体。Western blot分析和His标签纯化可用于检测重组蛋白的表达水平,是完成本方案后需进一步进行的后续实验步骤。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢加拿大创新基金会、不列颠哥伦比亚知识发展基金以及加拿大卫生研究院(CIHR)对本工作的支持。M.T. 获得了由TULA基金会资助的微生物多样性与进化研究中心(CMDE)提供的博士后奖学金支持。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

参考文献

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cereghino, G. P., Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).
  2. Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell.....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

AOX1 Zeocin c myc 6xHis Western

相关文章