本方案描述了利用甲醇酵母Pichia pastoris进行蛋白表达的方法。同时包括电转感受态酵母细胞的制备、将含有目的基因的载体转化至P. pastoris以及酵母DNA的纯化。最后步骤包括蛋白质的Western印迹分析和蛋白纯化。
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本方案描述了利用甲醇酵母Pichia pastoris进行蛋白表达的方法。同时包括电转感受态酵母细胞的制备、将含有目的基因的载体转化至P. pastoris以及酵母DNA的纯化。最后步骤包括蛋白质的Western印迹分析和蛋白纯化。
在微生物真核宿主Pichia pastoris中进行蛋白表达，可在一种快速且易于使用的表达系统中大量生产重组蛋白。
作为一种单细胞微生物，P. pastoris 易于操作，可在廉价培养基上以高细胞密度快速生长。作为真核生物，P. pastoris 能够执行许多高等真核细胞所进行的翻译后修饰，所获得的重组蛋白可发生蛋白质折叠、蛋白水解加工、二硫键形成以及糖基化[1]。
作为一种甲基营养型酵母，P. pastoris 能够以甲醇作为唯一碳源进行代谢。醇氧化酶基因 AOX1 的强启动子受到严格调控，并可被甲醇诱导，常用于目的基因的表达。因此，通过向培养基中添加甲醇即可诱导外源蛋白的表达[2; 3]。
另一个重要优势是利用信号序列将外源蛋白靶向巴斯德毕赤酵母（P. pastoris）的分泌途径，从而实现重组蛋白向培养基中的分泌。由于酵母自身向培养基分泌的内源性蛋白水平极低，且培养基中无外源添加蛋白，因此异源蛋白在培养基总蛋白中占主导地位，有利于后续的蛋白纯化步骤[3; 4]。
此处使用的载体（pPICZαA）包含AOX1启动子，可用于严格调控并在甲醇诱导下表达目的基因；含有α因子分泌信号，以实现重组蛋白的分泌；含有Zeocin抗性基因，可用于在E. coli和Pichia中进行筛选；以及一个C端肽段，该肽段包含c-myc表位和多聚组氨酸（6xHis）标签，用于重组蛋白的检测与纯化。我们还展示了利用特异性Anti-myc-HRP抗体对重组蛋白进行的Western印迹分析，该抗体可识别原始载体上的c-myc表位。
在甲醇酵母Pichia pastoris中表达重组蛋白
在开始本实验方案之前，您应已将目标基因正确地克隆至P. pastoris 空载载体中，并对载体进行测序，以确认目标基因已正确插入。
第一步：制备电转感受态酵母细胞、质粒线性化及转化至 P. pastoris
进行此步骤时，您需要准备好以下培养基和培养板：
第1部分：电转感受态酵母细胞的制备
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利用甲基营养型酵母进行蛋白质表达 Pichia pastoris 作为一种宿主系统在本方案中进行了描述。该蛋白可根据所使用的克隆载体分泌至培养基中。重组蛋白的分泌可简化后续纯化步骤。然而，所示条件可能需要针对不同蛋白的表达进行优化，条件及表达时间的改变可能会提高蛋白表达水平。本方案所用载体具有以下特征： c-myc 表位以及针对该表位的抗体均可购得。这使得研究人员能够分析目前尚无可用抗体的蛋白质。亲本载体上的His标签特性可实现蛋白质在金属螯合树脂上的纯化，且已有针对该载体His标签区域的抗体可供使用。
如本实验方案所述，在Pichia pastoris中进行蛋白表达是一个多步骤的过程，需要周密的规划和准备。完成所有步骤需要两到三周的时间（不包括目的基因表达载体的克隆时间）。成功转化P. pastoris的基础在于使用具有高转化效率的感受态酵母细胞，以及能够整合到酵母基因组中的线性化表达载体。Western blot分析和His标签纯化可用于检测重组蛋白的表达水平，是完成本方案后需进一步进行的后续实验步骤。
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感谢加拿大创新基金会、不列颠哥伦比亚知识发展基金以及加拿大卫生研究院（CIHR）对本工作的支持。M.T. 获得了由TULA基金会资助的微生物多样性与进化研究中心（CMDE）提供的博士后奖学金支持。
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