本方案描述了利用甲醇酵母Pichia pastoris进行蛋白表达的方法。同时包括电转感受态酵母细胞的制备、将含有目的基因的载体转化至P. pastoris以及酵母DNA的纯化。最后步骤包括蛋白质的Western印迹分析和蛋白纯化。
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摘要
摘要
在微生物真核宿主Pichia pastoris中进行蛋白表达，可在一种快速且易于使用的表达系统中大量生产重组蛋白。
作为一种单细胞微生物，P. pastoris 易于操作，可在廉价培养基上以高细胞密度快速生长。作为真核生物，P. pastoris 能够执行许多高等真核细胞所进行的翻译后修饰，所获得的重组蛋白可发生蛋白质折叠、蛋白水解加工、二硫键形成以及糖基化[1]。
作为一种甲基营养型酵母，P. pastoris 能够以甲醇作为唯一碳源进行代谢。醇氧化酶基因 AOX1 的强启动子受到严格调控，并可被甲醇诱导，常用于目的基因的表达。因此，通过向培养基中添加甲醇即可诱导外源蛋白的表达[2; 3]。
另一个重要优势是利用信号序列将外源蛋白靶向巴斯德毕赤酵母（P. pastoris）的分泌途径，从而实现重组蛋白向培养基中的分泌。由于酵母自身向培养基分泌的内源性蛋白水平极低，且培养基中无外源添加蛋白，因此异源蛋白在培养基总蛋白中占主导地位，有利于后续的蛋白纯化步骤[3; 4]。
此处使用的载体（pPICZαA）包含AOX1启动子，可用于严格调控并在甲醇诱导下表达目的基因；含有α因子分泌信号，以实现重组蛋白的分泌；含有Zeocin抗性基因，可用于在E. coli和Pichia中进行筛选；以及一个C端肽段，该肽段包含c-myc表位和多聚组氨酸（6xHis）标签，用于重组蛋白的检测与纯化。我们还展示了利用特异性Anti-myc-HRP抗体对重组蛋白进行的Western印迹分析，该抗体可识别原始载体上的c-myc表位。
方案
在甲醇酵母Pichia pastoris中表达重组蛋白
在开始本方案之前，您应已将目标基因正确地克隆至P. pastoris 父载体中的阅读框内，并对载体进行测序，以确认目标基因已正确插入。
第一步：制备电转感受态酵母细胞、质粒线性化及转化至 P. pastoris
进行此步骤时，您需要准备好以下培养基和培养板：
- YPDS 平板
- 600 mL YPD 培养基
- 预冷的无菌水
- 1 M 山梨醇
- Amicon Ultra-4 离心过滤装置
- Microcon YM-30 离心过滤单元
- 0.2 cm 电穿孔比色皿
- 15 mL 无菌玻璃试管
- 无菌玻璃巴斯德吸管
- 含 Zeocin 的 YPDS 平板
第1部分：电转感受态酵母细胞的制备
- 在计划进行转化的四天前，将 P. pastoris 细胞划线接种于不含 Zeocin 的 YPDS 平板上，并在 30°C 下培养 1–2 天，直至形成单菌落。
- 在计划进行转化的两天前，将 5 ml 的 P. pastoris 菌株接种于 50 ml Falcon 管中的 YPD 培养基中，在 30°C 下过夜培养。将 Falcon 管放入三角瓶中固定，置于摇床中培养。
- 在转化前一天，将 0.25 ml 过夜培养物接种至 2 升三角瓶中的 500 ml 新鲜 YPD 培养基中，再次于 30°C 摇床中过夜培养，使菌液 OD600 达到 1.3–1.5。
注意：在分光光度计上测量前应稀释样品，以获得准确结果。 - 在转化当天，准备好冰冻的无菌水和 1 M 山梨醇溶液。在 4°C 下以 1500 × g 离心 5 分钟收集细胞。用 500 ml 冰冻的无菌水重悬沉淀。
- 再次按照步骤 4 的条件离心细胞。用 250 ml 冰冻的无菌水重悬沉淀。
- 再次按照步骤 4 的条件离心细胞。用 20 ml 冰冻的 1 M 山梨醇溶液重悬沉淀。
- 再次按照步骤 4 的条件离心细胞。将沉淀重悬于 1 ml 冰冻的 1 M 山梨醇溶液中，终体积约为 1.5 ml。将细胞置于冰上或 4°C 保存，直至后续使用。
注意：我们制备的电转感受态细胞量通常多于实际需要量，并将其分装为每管 80 μl，置于微量离心管中于 -80 °C 保存。储存的细胞在一个月内使用完毕。
第2部分：pPICZαA 载体的线性化与浓度测定
为了进行转化，通过限制性酶切将含有目的基因的载体线性化。我们使用 PmeI 酶，也可使用其他限制性酶切位点。必须确保插入片段中不含用于载体线性化的限制性酶切位点。将DNA转化至 P. pastoris 时，需要将5-20 μg的线性化DNA溶于5-10 μl无菌水中。
同时将不含插入片段的普通载体线性化、浓缩，并转入 P. pastoris 中。不含插入片段的亲本载体可用于检测胞内本底表达水平，作为对照，有助于解释表达结果。
- 将所有试剂在冰上解冻，混合以下试剂，并短暂离心使液体全部沉至管底，轻弹管壁后再次离心：
- x μl 无菌水
- 5.0 μl 10X NEBuffer 4
- 0.5 μl 100X BSA
- 最多 2 μg 载体 DNA（~ 100 ng/μl）
- 2.0 μl PmeI 酶混合液
注意：为获得足量的线性化载体 DNA，需在多个独立离心管中分别配制上述混合液 3 或 4 份，随后在使用 Amicon Ultra 离心浓缩装置浓缩消化后的 DNA 时将各管溶液合并。 - 在 37°C 下孵育 3 小时，随后在 65°C 下加热 20 分钟以灭活酶混合液。
- 在此期间，用 1 mL Milli-Q 水预冲洗 Amicon Ultra-4 离心滤膜装置，以 4000 × g 离心 6–8 分钟，弃去滤过液。
注意：滤膜一旦润湿后切勿使其干燥。若预冲洗后暂不使用该装置，应保持滤膜上有水，直至使用前再弃去。 - 将第 2 步中热灭活后的溶液转移至已预冲洗的 Amicon 离心滤膜装置中，以 4000 × g 离心 6–8 分钟，弃去滤过液。
注意：若已制备多份线性化反应液，应将所有溶液合并至同一个 Amicon 离心滤膜装置中。 - 离心至 Amicon 滤膜上溶液体积减少至约 100 ~ 150 μl。将上一步中空离心管用 1.5 mL 无菌水润洗，然后将此水加入 Amicon 滤膜装置中，混匀后重复离心步骤。再用 1.5 mL 无菌水洗涤一次，再次弃去滤过液。最终体积浓缩至约 150 μl。洗涤步骤可去除缓冲液中残留的盐分，防止电穿孔时发生电弧现象。
注意：我们使用摆动桶转子进行离心；可将盖好的 Amicon 离心滤膜装置放入 50 mL Falcon 管中固定位置。即使经过长时间离心，Amicon 滤膜装置仍会保留约 50 μl 溶液在滤膜上。 - 为进一步浓缩 DNA 样品，将 Amicon 滤膜装置中剩余的 DNA 溶液转移至已预冲洗的 Microcon YM-30 离心滤膜装置中，并用额外 50 μl 无菌水冲洗 Amicon 管以回收全部 DNA。在微量离心机中以 10,000 × g 离心 Microcon 离心滤膜装置，直至滤膜表面仍轻微覆盖液体为止。仅短时间离心，并每隔一分钟检查滤膜上剩余液体量。当液体量极少时即停止离心。为回收 DNA 溶液，将滤膜装置倒置放入新的微量离心管中，在第二次离心步骤中以 1000 × g 离心 3 分钟。最终总体积不应超过 10–15 μl，否则 DNA 可能因过于稀释而影响转化效率。
注意：切勿离心过久，避免滤膜完全干燥，以防样品损失。若滤膜已干燥，可加入 10–15 μl 无菌水至膜表面，轻轻晃动 30 秒，然后按上述方法回收 DNA。
第3部分：通过电穿孔法将外源基因转化至P. pastoris
- 含有目的片段的线性化且浓缩的 pPICZαA DNA 现已准备好用于转化电转感受态的 P. pastoris 细胞（参见步骤 I，第 2 部分）。在转化前约 15 分钟，准备好以下试剂和设备：取一个微量离心管加入 1 mL 冰上预冷的 1 M 山梨醇；将一个 0.2 cm 电穿孔杯置于冰上；标记一个无菌的 15 mL 玻璃试管，并准备好一支无菌玻璃巴斯德吸管。
- 将步骤 I 第 2.7 步中 80 μl 的细胞转移至预冷的 0.2 cm 电穿孔杯中。加入步骤 I 第 3.6 步中浓缩的线性化 pPICZαA DNA 溶液，并通过在电穿孔杯中左右移动移液器吸头来混匀。
注意：加入 DNA 时，仅将移液器按至第一档。在将 DNA 与细胞混匀后，将移液器按至第二档，然后缓慢从电穿孔杯中取出。 - 将装有细胞的电穿孔杯置于冰上孵育 5 分钟。
- 用纸巾擦拭电穿孔杯外壁，然后根据所用电穿孔仪制造商推荐的酵母（Saccharomyces cerevisiae）参数进行电击。
注意：我们使用 Bio-Rad GenePulser，设置如下：- 充电电压 (V)：1500；
- 电容 (μF)：25；
- 电阻 (Ω)：200。
- 立即向电穿孔杯中加入 1 mL 冰冷的 1 M 山梨醇。使用无菌玻璃巴斯德吸管将杯内液体转移至无菌 15 mL 试管中。
- 将试管在 30°C 下静置孵育 1.5 小时，不振荡。
- 在四个含有 100 μg/mL Zeocin 的标记 YPDS 平板上各加入 5–7 颗无菌玻璃珠。从 15 mL 玻璃试管中取 250 μl 电穿孔混合液涂布于每个平板上。水平轻摇平板使细胞均匀分布。让平板静置干燥 15 分钟，然后通过倒置平板去除琼脂表面的玻璃珠。
注意：我们使用 100 μg/mL Zeocin 对 GS115 Pichia 菌株的转化子进行筛选。若使用其他 Pichia 菌株，筛选条件可能有所不同。 - 将平板倒置，在 30°C 下培养 2 至 3 天，直至菌落形成。用黑色塑料袋包裹平板，以防止光敏性的 Zeocin 降解。平板中抗生素浓度过低可能导致假阳性克隆的出现。
- 菌落形成后，挑选 12 个菌落，并通过在含有 100 μg/mL Zeocin 的新鲜 YPDS 平板上划线接种进行纯化。
第二步：蛋白质表达 Pichia pastoris
进行此步骤时，您需要准备好以下培养基、培养皿和试剂：
- BMGY 培养基
- 甘油，已灭菌
- BMMY 培养基
- 甲醇，已灭菌
- EPICENTRE 酵母 DNA 纯化试剂盒
您还需要以下烧瓶：
- 250 mL 锥形瓶，已灭菌
- 1 L 带挡板锥形瓶，已灭菌
- 200 mL 烧杯，已灭菌
第1部分：Pichia pastoris中的蛋白质表达
以下所有步骤同样适用于转化后的对照载体（无插入片段）。
- 从纯化后的平板上挑取单个菌落 毕赤酵母 步骤I，第3.9部分中的菌落，接种于25 mL BMGY培养基中，使用无菌250 mL三角瓶。置于30 °C，250 rpm振荡培养。 30°C 在摇床培养箱（250-300 rpm）中振荡培养，直至菌液达到指定的OD值600 2-6（约16-18小时）。
注意：在分光光度计上测量前，请先稀释样品，以获得准确结果。细胞将处于对数生长期。 - 当细胞达到适当的 OD 时600 制备甘油菌种保存液。转移 800 μl 将25 mL细胞培养物转移至一个2 mL Corning冻存管中，并加入 200 μl 无菌甘油。将甘油菌种保存液冷冻并置于 -80°C.
- 用于酵母DNA纯化时，取25 mL细胞培养液中的1.5 mL转移至微量离心管中。在室温下以1300 × g离心1分钟收集细胞。这些细胞用于分析 Pichia 整合子用于再次验证目的基因是否已整合到 毕赤酵母 基因组（参见步骤 II，第2部分）。将细胞沉淀物保存在 4°C 直至进一步分析。
- 将剩余的25 mL培养物转移至50 mL Falcon离心管中，在室温下以3000 × g离心5分钟收集细胞。弃去上清液，将离心管倒置于纸巾上以去除残留培养基。为洗涤细胞沉淀，用20 mL BMMY重悬沉淀，以去除残留的BMGY培养基，因为BMGY培养基中的甘油可能抑制后续的表达。再次在室温下以3000 × g离心5分钟，弃去上清液。
- 重悬细胞沉淀至 OD600 在BMMY培养基中诱导表达至OD600为1.0（约100-200 mL），并将菌液转移至1升挡板摇瓶中。用200 mL烧杯覆盖瓶口，放回培养箱继续培养 30°C.
注意：温度不得超过 30°C如果您的培养箱温度波动，将温度设定在 28°C充分的通气也是甲醇诱导过程中实现高效表达的重要参数（诱导表达时，培养液体积切勿超过 > 总体积的10-30%）。我们强烈推荐使用带挡板的摇瓶，因为其可向培养基中引入更多氧气。 - 每24小时添加灭菌的纯甲醇，使甲醇终浓度为0.5%，以维持诱导。
- 在诱导表达开始后的特定时间点，取1 mL培养物转移至1.5 mL微量离心管中。室温下以1300 × g离心2.5分钟。将上清液转移至另一支1.5 mL微量离心管中。将上清液和菌体沉淀保存于-80°C 直至进一步分析。将分析不同时间点的样品，以确定诱导后蛋白表达的最佳时间 period。
注：我们选择6 h、12 h、24 h、36 h和48 h作为取样时间点。可进一步培养至4天。不同表达蛋白的最适时间点有所不同。 - 通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE和蛋白质印迹法（本方案未描述）分析上清液和细胞沉淀中的蛋白质表达。
第2部分：酵母DNA纯化及PCR分析 毕赤酵母 整合子
在BMGY培养基中对Pichia菌株进行酵母DNA纯化所需的全部试剂均包含在EPICENTRE公司的MasterPure Yeast DNA Purification Kit中。
注意：该分析为附加步骤，用于检测目的基因是否已整合至Pichia基因组中。使用从BMGY培养物中取样的1.5 mL样品（参见步骤II，第1.3部分）离心后获得的细胞沉淀进行后续操作。
按照Epicentre MasterPure酵母DNA纯化试剂盒说明书操作，使用酵母DNA和插入片段特异性引物进行PCR扩增。取3 μl PCR产物，在含有1 μl溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。在其中一个泳道中加入1 Kb+ DNA分子量标记，以判断插入片段的大小，并使用凝胶成像系统观察DNA条带。
可通过蛋白质印迹分析检测重组蛋白。可使用金属离子负载树脂进行His标签蛋白纯化（本方案中未描述该步骤）。
附录，配方列表
步骤一：
- YPD 培养基：
制备 600 mL YPD 培养基（酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基），将 5 g 酵母提取物和 12 g 蛋白胨溶解于 540 mL 水中。在液体循环条件下高压灭菌 20 分钟。
同时，准备 70 mL 20% 葡萄糖溶液，并在使用前经滤膜除菌。
待高压灭菌后的溶液冷却至约 60°C，加入 60 mL 滤膜除菌的 20% 葡萄糖溶液。 - YPDS（含 Zeocin）平板：
制备 500 mL YPDS + Zeocin 琼脂培养基（含山梨醇的酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基），将 5 g 酵母提取物、91.1 g 山梨醇和 10 g 蛋白胨溶解于 450 mL 水中。加入 10 g 琼脂和一个磁力搅拌子，在液体循环条件下高压灭菌 20 分钟。
同时，准备 60 mL 20% 葡萄糖溶液，并在使用前经滤膜除菌。
待高压灭菌后的溶液冷却至约 60°C，加入 50 mL 滤膜除菌的 20% 葡萄糖溶液。
在加入抗生素之前，先倾注若干平板以制备不含 Zeocin 的 YPDS 平板。然后从 100 mg/mL 的储备液中加入 500 μL Zeocin，使琼脂中的终浓度为 100 μg/mL。加入抗生素时需在磁力搅拌器上搅拌，并继续搅拌约额外 2 分钟以确保均匀混合。
将培养基倒入培养皿中，并用黑色塑料膜覆盖。将平板置于实验台面上过夜晾干。含 Zeocin 的 YPD 平板储存于 4°C，保质期为一至两周。
注意：使用塑料膜覆盖是必要的，因为 Zeocin 对光敏感。
步骤二：
- BMGY（缓冲甘油复合培养基）和 BMMY（缓冲甲醇复合培养基）：
分别将 8 g 酵母提取物和 16 g 蛋白胨溶解于 560 mL 水中。液体循环条件下高压灭菌 20 分钟。
在此期间，配制以下溶液：- 1 M 磷酸钾缓冲液，pH 6.0：
- 10X YNB（含硫酸铵、不含氨基酸的 13.4% 酵母氮源基础）：
- 500X B（0.02% 生物素）：
- 10X M（5% 甲醇）：
- 10X GY（10% 甘油）
待高压灭菌的溶液冷却至室温后，加入以下成分并充分混匀：- 80 mL 1 M 磷酸钾缓冲液，pH 6.0；
- 80 mL 10X YNB
- 0.16 mL 500X B
- 80 mL 10X GY
培养基于 4°C 保存。该溶液保质期约为两个月。
代表性结果
图1. 该蛋白免疫印迹图像显示了表达24小时后的四种蛋白（标记为1605、0537、1228和1682）。用于免疫印迹的抗体为c-myc-HRP抗体。第二泳道（标记为N）为阴性对照，加样内容为未表达重组蛋白的细胞上清液，这些细胞因转化了空载体（原始载体）而不表达目标蛋白。
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讨论
利用甲基营养型酵母进行蛋白质表达 Pichia pastoris 作为一种宿主系统在本方案中进行了描述。该蛋白可根据所使用的克隆载体分泌至培养基中。重组蛋白的分泌可简化后续纯化步骤。然而，所示条件可能需要针对不同蛋白的表达进行优化，条件及表达时间的改变可能会提高蛋白表达水平。本方案所用载体具有以下特征： c-myc 表位以及针对该表位的抗体均可购得。这使得研究人员能够分析目前尚无可用抗体的蛋白质。亲本载体上的His标签特性可实现蛋白质在金属螯合树脂上的纯化，且已有针对该载体His标签区域的抗体可供使用。
如本实验方案所述，在Pichia pastoris中进行蛋白表达是一个多步骤的过程，需要周密的规划和准备。完成所有步骤需要两到三周的时间（不包括目的基因表达载体的克隆时间）。成功转化P. pastoris的基础在于使用具有高转化效率的感受态酵母细胞，以及能够整合到酵母基因组中的线性化表达载体。Western blot分析和His标签纯化可用于检测重组蛋白的表达水平，是完成本方案后需进一步进行的后续实验步骤。
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致谢
感谢加拿大创新基金会、不列颠哥伦比亚知识发展基金以及加拿大卫生研究院（CIHR）对本工作的支持。M.T. 获得了由TULA基金会资助的微生物多样性与进化研究中心（CMDE）提供的博士后奖学金支持。
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参考文献
- Cereghino, G. P., Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).
- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).
- Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).
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