方法文章

在甲醇酵母 Pichia pastoris 中表达重组蛋白

DOI:

10.3791/1862

2010年2月25日

本文内容

摘要

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了利用甲醇酵母Pichia pastoris进行蛋白表达的方法。同时包括电转感受态酵母细胞的制备、将含有目的基因的载体转化至P. pastoris以及酵母DNA的纯化。最后步骤包括蛋白质的Western印迹分析和蛋白纯化。

摘要

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在微生物真核宿主Pichia pastoris中进行蛋白表达,可在一种快速且易于使用的表达系统中大量生产重组蛋白。

作为一种单细胞微生物,P. pastoris 易于操作,可在廉价培养基上以高细胞密度快速生长。作为真核生物,P. pastoris 能够执行许多高等真核细胞所进行的翻译后修饰,所获得的重组蛋白可发生蛋白质折叠、蛋白水解加工、二硫键形成以及糖基化[1]。

作为一种甲基营养型酵母,P. pastoris 能够以甲醇作为唯一碳源进行代谢。醇氧化酶基因 AOX1 的强启动子受到严格调控,并可被甲醇诱导,常用于目的基因的表达。因此,通过向培养基中添加甲醇即可诱导外源蛋白的表达[2; 3]。

另一个重要优势是利用信号序列将外源蛋白靶向巴斯德毕赤酵母(P. pastoris)的分泌途径,从而实现重组蛋白向培养基中的分泌。由于酵母自身向培养基分泌的内源性蛋白水平极低,且培养基中无外源添加蛋白,因此异源蛋白在培养基总蛋白中占主导地位,有利于后续的蛋白纯化步骤[3; 4]。

此处使用的载体(pPICZαA)包含AOX1启动子,可用于严格调控并在甲醇诱导下表达目的基因;含有α因子分泌信号,以实现重组蛋白的分泌;含有Zeocin抗性基因,可用于在E. coliPichia中进行筛选;以及一个C端肽段,该肽段包含c-myc表位和多聚组氨酸(6xHis)标签,用于重组蛋白的检测与纯化。我们还展示了利用特异性Anti-myc-HRP抗体对重组蛋白进行的Western印迹分析,该抗体可识别原始载体上的c-myc表位。

方案

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在甲醇酵母Pichia pastoris中表达重组蛋白

在开始本实验方案之前,您应已将目标基因正确地克隆至P. pastoris 空载载体中,并对载体进行测序,以确认目标基因已正确插入。

第一步:制备电转感受态酵母细胞、质粒线性化及转化至 P. pastoris

进行此步骤时,您需要准备好以下培养基和培养板:

  • YPDS 平板
  • 600 mL YPD 培养基
  • 预冷的无菌水
  • 1 M 山梨醇
  • Amicon Ultra-4 离心过滤装置
  • Microcon YM-30 离心过滤单元
  • 0.2 cm 电穿孔比色皿
  • 15 mL 无菌玻璃试管
  • 无菌玻璃巴斯德吸管
  • 含 Zeocin 的 YPDS 平板

第1部分:电转感受态酵母细胞的制备

  1. 在计划进行转化的四天前,将 P. pastoris 细胞划线接种于不含 Zeocin 的 YPDS 平板上,并在 30°C 下培养 1–2 天,直至形成单菌落。
  2. 在计划进行转化的两天前,将 5 ml 的 P. pastoris 菌株接种于 50 ml 离心管中的 YPD 培养基中,在 30°C 下过夜培养。将离心管放入三角烧瓶中固定,置于摇床中培养。
  3. 转化前一天,用 0.25 ml 过夜培养物接种 2 升三角烧瓶中的 500 ml 新鲜 YPD 培养基,并在 30°C 摇床中继续过夜培养,使菌液 OD600 达到 1.3–1.5。
    注意:在分光光度计上测量前需稀释样品,以获得准确结果。
  4. 转化当天,准备好冰上预冷的无菌水和 1 M 山梨醇溶液。在 4°C 下以 1500 × g 离心 5 分钟收集细胞,然后用 500 ml 冰上预冷的无菌水重悬沉淀。
  5. 再次按照步骤 4 的条件离心细胞,然后用 250 ml 冰上预冷的无菌水重悬沉淀。
  6. 再次按照步骤 4 的条件离心细胞,然后用 20 ml 冰上预冷的 1 M 山梨醇溶液重悬沉淀。
  7. 再次按照步骤 4 的条件离心细胞,然后用 1 ml 冰上预冷的 1 M 山梨醇溶液重悬沉淀,终体积约为 1.5 ml。将细胞悬液置于冰上或 4°C 保存,待后续使用。
    注意:我们制备的电转感受态细胞通常多于实际所需量,并分装为每管 80 μl 存放于微量离心管中,于 -80 °C 保存。储存的细胞在一个月内使用完毕。

第2部分:pPICZαA 载体的线性化与浓缩

为了进行转化,通过限制性酶切将含有目的基因的载体线性化。我们使用 PmeI 酶,也可使用其他限制性酶切位点。必须确保插入片段中不含有用于载体线性化的限制性酶切位点。将 DNA 线性化后,用于转化入 P. pastoris 的量为 5–20 μg,溶于 5–10 μl 无菌水中。

同时将无插入片段的普通载体线性化、浓缩,并转入P. pastoris中。不含插入片段的原始载体可作为细胞内本底表达的对照,有助于您解读表达结果。

  1. 将所有试剂在冰上解冻,混合以下试剂,并短暂离心使液体全部沉至管底,轻弹管壁后再次离心:
    • x μl 无菌水
    • 5.0 μl 10X NEBuffer 4
    • 0.5 μl 100X BSA
    • 最多 2 μg 载体 DNA(约 100 ng/μl)
    • 2.0 μl PmeI 酶混合液
    → 总反应体积为 50 μl
    注意:为获得足量的线性化载体 DNA,建议在多个独立的离心管中分别配制上述反应体系 3 至 4 份,在使用 Amicon Ultra 离心浓缩装置浓缩消化后的 DNA 时再将各管溶液合并。
  2. 在 37°C 下孵育 3 小时,随后在 65°C 下加热 20 分钟以灭活酶混合液。
  3. 在此期间,用 1 mL Milli-Q  水预冲洗 Amicon Ultra-4 离心滤过装置,于 4000 × g 离心 6–8 分钟,弃去滤过液。
    注意:膜润湿后切勿使其干燥。若预冲洗后暂不使用该装置,请在膜上保留少量水,直至使用前再弃去。
  4. 将第 2 步中热灭活后的反应液转移至已预冲洗的 Amicon 离心滤过装置中,于 4000 × g 离心 6–8 分钟,弃去滤过液。
    注意:若已制备多份线性化反应液,请将所有溶液合并至同一个 Amicon 离心滤过装置中。
  5. 继续离心,直至 Amicon 滤膜上的溶液体积减少至约 100 ~ 150 μl。将上一步的空管中加入 1.5 mL 无菌水,混匀后转移至 Amicon 管中,重复离心步骤。再用 1.5 mL 无菌水洗涤一次,并再次弃去滤过液,最终将体积浓缩至约 150 μl。洗涤步骤可去除缓冲液中残留的盐分,防止电穿孔时发生电弧现象。
    注意:本步骤使用摆动转子离心机;只需将盖紧的 Amicon 离心滤过装置放入 50 mL Falcon 管中固定即可。即使经过长时间离心,Amicon 滤膜仍会保留约 50 μl 溶液。
  6. 为进一步浓缩 DNA 样品,将 Amicon 滤过装置中剩余的 DNA 溶液转移至已预冲洗的 Microcon YM-30 离心滤过装置中,并用额外 50 μl 无菌水冲洗 Amicon 管以回收全部 DNA。在微量离心机中以 10,000 × g 离心 Microcon 离心滤过装置,直至滤膜表面仍轻微覆盖液体为止。若滤膜上液体量较少,每次仅短时间离心,并每隔一分钟检查一次。为回收 DNA 溶液,将滤过装置倒置放入新的微量离心管中,在第二次离心步骤中以 1000 × g 离心 3 分钟。最终体积不应超过 10–15 μl,否则 DNA 可能因浓度过低而影响转化效率。
    注意:切勿离心过久,避免滤膜完全干燥,以防样品损失。若膜已干燥,可在膜上加入 10–15 μl 无菌水,轻轻振荡 30 秒,然后按上述方法回收 DNA。

第3部分:通过电穿孔法将目的基因转化至P. pastoris

  1. 含有目的片段的线性化且浓缩的 pPICZαA DNA 现已准备好用于转化电转感受态的 P. pastoris 细胞(参见步骤 I,第 2 部分)。在转化前约 15 分钟,准备好以下试剂和设备:取一个微量离心管加入 1 mL 冰上预冷的 1 M 山梨醇;将一个 0.2 cm 电穿孔杯置于冰上;标记一个无菌的 15 mL 玻璃试管,并准备好一支无菌玻璃巴斯德吸管。
  2. 将步骤 I 第 2.7 部分中的 80 μl 细胞转移至预冷的 0.2 cm 电穿孔杯中。加入步骤 I 第 3.6 部分中获得的浓缩线性化 pPICZαA DNA 溶液,并通过在电穿孔杯中左右移动移液器吸头来混匀。
    注意:加入 DNA 时仅将移液器按至第一档。在将 DNA 与细胞混匀后,将移液器按至第二档,然后缓慢从电穿孔杯中取出。
  3. 将含有细胞的电穿孔杯置于冰上孵育 5 分钟。
  4. 用纸巾擦拭电穿孔杯外壁,然后根据所用电穿孔仪器制造商推荐的酵母(Saccharomyces cerevisiae)参数进行电击。
    注意:我们使用 Bio-Rad GenePulser,设置如下:
    • 充电电压 (V):1500;
    • 电容 (μF):25;
    • 电阻 (Ω):200。
    使用 0.2 cm 电穿孔杯时,该程序产生的脉冲时长约 ~10 ms,电场强度约为 ~7500 V/cm。
  5. 立即向电穿孔杯中加入 1 mL 冰冷的 1 M 山梨醇。使用无菌玻璃巴斯德吸管将杯内液体转移至无菌 15 mL 试管中。
  6. 将试管在 30°C 下静置孵育 1.5 小时,不振荡。
  7. 在四个标好记号、含有 100 μg/mL Zeocin 的 YPDS 平板上各加入 5–7 颗无菌玻璃珠。从 15 mL 玻璃试管中取 250 μl 电穿孔混合液涂布于每个平板上。水平轻摇平板使细胞均匀分布。让平板静置干燥 15 分钟,然后通过倒置平板去除琼脂表面的玻璃珠。
    注意:当使用 GS115 Pichia 菌株时,我们采用 100 μg/mL Zeocin 进行转化子筛选。若使用其他 Pichia 菌株,筛选条件可能有所不同。
  8. 将平板倒置,在 30°C 下培养 2 至 3 天,直至菌落形成。用黑色塑料袋包裹平板,以防止光敏性的 Zeocin 降解。平板中抗生素浓度过低可能导致假阳性克隆的出现。
  9. 菌落形成后,挑选 12 个菌落,并通过在含有 100 μg/mL Zeocin 的新鲜 YPDS 平板上划线分离的方式进行纯化。

第二步:蛋白表达于 Pichia pastoris

进行此步骤时,您需要准备好以下培养基、培养板和试剂:

  • BMGY 培养基
  • 甘油,已灭菌
  • BMMY 培养基
  • 甲醇,已灭菌
  • EPICENTRE 酵母 DNA 纯化试剂盒

您还需要以下烧瓶:

  • 250 mL 锥形瓶,已灭菌
  • 1 L 带挡板锥形瓶,已灭菌
  • 200 mL 烧杯,已灭菌

第1部分:Pichia pastoris中的蛋白质表达

以下所有步骤同样适用于转化后的对照载体(无插入片段)。

  1. 从步骤 I 第 3.9 部分纯化的 Pichia 菌落中挑取单个菌落,接种于无菌 250 mL 锥形瓶中的 25 mL BMGY 培养基中。在 30°C 摇床培养箱(250–300 rpm)中培养,直至菌液 OD600 达到 2–6(约 16–18 小时)。
    注意:在分光光度计上测量前需稀释样品,以获得准确结果。此时细胞处于对数生长期。
  2. 当细胞达到合适的 OD600 时,制备甘油保存液。将 25 mL 菌液中的 800 μL 转移至 2 mL Corning 冻存管中,加入 200 μL 无菌甘油。将甘油保存液冷冻后于 -80°C 保存。
  3. 为进行酵母 DNA 纯化,将 25 mL 菌液中的 1.5 mL 转移至微量离心管中。在室温下以 1300 × g 离心 1 分钟收集细胞。这些细胞用于分析 Pichia 整合子,以确认目的基因是否已整合至 Pichia 基因组中(见步骤 II 第 2 部分)。将细胞沉淀在 4°C 保存,待进一步分析。
  4. 将剩余的 25 mL 菌液转移至 50 mL Falcon 管中,在室温下以 3000 × g 离心 5 分钟收集细胞。弃去上清液,将离心管倒置于纸巾上以去除残留培养基。用 20 mL BMMY 重悬细胞沉淀,以去除残留的 BMGY 培养基,因为 BMGY 中的甘油可能抑制后续表达。再次在室温下以 3000 × g 离心 5 分钟,弃去上清液。
  5. 用 BMMY 培养基将细胞沉淀重悬至 OD600 = 1.0(约 100–200 mL),以诱导表达,并将菌液转移至 1 L 带挡板的锥形瓶中。用 200 mL 烧杯盖住瓶口,放回培养箱中于 30°C 继续培养。
    注意:温度不得超过 30°C。若培养箱温度波动,建议设定为 28°C。充足的通气是甲醇诱导期间高效表达的重要参数(诱导表达时,培养液体积切勿超过总瓶体积的 > 10–30%)。我们强烈推荐使用带挡板的锥形瓶,因其可向培养基中引入更多氧气。
  6. 每隔 24 小时加入无菌纯甲醇,使甲醇终浓度为 0.5%,以维持诱导表达。
  7. 在诱导表达开始后的特定时间点,取 1 mL 菌液转移至 1.5 mL 微量离心管中。在室温下以 1300 × g 离心 2.5 分钟。将上清液转移至另一支 1.5 mL 微量离心管中。将上清液和细胞沉淀在 -80°C 保存,待进一步分析。通过分析不同时间点的样品,确定诱导后蛋白表达的最佳时间。
    注意:我们选择 6 小时、12 小时、24 小时、36 小时和 48 小时作为取样时间点。最长可继续培养至 4 天。不同表达蛋白的最佳时间点可能不同。
  8. 通过考马斯亮蓝染色的 SDS-PAGE 和 Western 印迹分析上清液和细胞沉淀中的蛋白表达(本方案未描述具体操作)。

第二部分:酵母DNA纯化及PCR分析 Pichia 整合子

用于巴斯德毕赤酵母(Pichia)培养物在BMGY培养基中进行酵母DNA纯化步骤的所有试剂均包含在EPICENTRE公司的MasterPure酵母DNA纯化试剂盒中。
注意:该分析为附加步骤,用于检测目的基因是否已整合到巴斯德毕赤酵母(Pichia)基因组中。使用从BMGY培养物中取样的1.5 mL样品所获得的细胞沉淀(见步骤II,第1.3部分)进行分析。

按照Epicentre MasterPure酵母DNA纯化试剂盒说明书进行操作,并使用针对插入片段的特异性引物对酵母DNA进行PCR扩增。取3 μl PCR产物,在含有1 μl溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。在其中一个泳道中加入1 Kb+ DNA标准分子量标记,以判断插入片段的大小,并使用凝胶成像系统观察DNA条带。

可通过蛋白质印迹分析检测重组蛋白。可使用金属离子负载树脂进行His标签蛋白纯化(本方案中未描述该步骤)。

附录,配方列表

步骤一:

  1. YPD培养基
    制备600 mL YPD培养基(酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基),将5 g酵母提取物和12 g蛋白胨溶解于540 mL水中。在液体循环条件下高压灭菌20分钟。
    同时,准备70 mL 20%葡萄糖溶液,并在使用前过滤除菌。
    待高压灭菌后的溶液冷却至约60°C,加入60 mL过滤除菌的20%葡萄糖溶液。
  2. YPDS(+ Zeocin)平板
    制备500 mL YPDS + Zeocin琼脂培养基(含山梨醇的酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基),将5 g酵母提取物、91.1 g山梨醇和10 g蛋白胨溶解于450 mL水中。加入10 g琼脂和一个磁力搅拌子,在液体循环条件下高压灭菌20分钟。
    同时,准备60 mL 20%葡萄糖溶液,并在使用前过滤除菌。
    待高压灭菌后的溶液冷却至约60°C,加入50 mL过滤除菌的20%葡萄糖溶液。
    在添加抗生素之前,先倒几块不含Zeocin的YPDS平板。然后从100 mg/mL的储备液中加入500 μL Zeocin,使琼脂中的终浓度为100 μg/mL。加入抗生素后,在磁力搅拌器上搅拌,并继续搅拌约2分钟,以确保均匀混合。
    将培养基倒入培养皿中,并用黑色塑料膜覆盖。室温下静置过夜使其干燥。含Zeocin的YPD平板储存于4°C,保质期为一至两周。
    注意:使用黑色塑料膜覆盖是必要的,因为Zeocin对光敏感。

第二步:

  1. BMGY(缓冲甘油复合培养基)和 BMMY(缓冲甲醇复合培养基)
    将每种培养基的 8 g 酵母提取物和 16 g 蛋白胨溶解于 560 mL 水中。在液体循环条件下高压灭菌 20 分钟。
    同时配制以下溶液:
    • 1 M 磷酸钾缓冲液,pH 6.0
    取 24 mL 1 M K2HPO4 和 156 mL 1 M KH2PO4 混合,并确认 pH = 6.0(若需调节 pH,使用磷酸或 KOH)。过滤除菌后室温保存。该溶液有效期超过一年。
    • 10X YNB(含硫酸铵、不含氨基酸的 13.4% 酵母氮源基础)
    将 26.8 g 含硫酸铵、不含氨基酸的酵母氮源基础(YNB)溶解于 200 mL 水中,过滤除菌。加热溶液以使 YNB 完全溶解。4°C 保存。该溶液有效期约为一年。注意:也可使用 3.4 g 不含硫酸铵和氨基酸的 YNB,并额外加入 10 g 硫酸铵。
    • 500X B(0.02% 生物素)
    将 10 mg 生物素溶解于 50 mL 水中,过滤除菌。4°C 保存。该溶液有效期约为一年。
    • 10X M(5% 甲醇)
    将 5 mL 甲醇与 95 mL 水混合,过滤除菌,4°C 保存。该溶液有效期约为两个月。
    • 10X GY(10% 甘油)
    将 10 mL 甘油与 90 mL 水混合,过滤除菌。室温保存。该溶液有效期超过一年。
    待高压灭菌的溶液冷却至室温后,加入以下组分并充分混匀:
    • 80 mL 1 M 磷酸钾缓冲液,pH 6.0;
    • 80 mL 10X YNB
    • 0.16 mL 500X B
    • 80 mL 10X GY
    配制 BMMY 时,用 80 mL 10X M 替代 10X GY。
    培养基于 4°C 保存。该溶液有效期约为两个月。

代表性结果

figure-protocol-1
图1. 该蛋白免疫印迹图像显示了表达24小时后的四种蛋白(标记为1605、0537、1228和1682)。免疫印迹所用抗体为c-myc-HRP抗体。第二泳道(标记为N)为阴性对照,加样内容为未表达重组蛋白的细胞上清液,这些细胞因转化了空载体(普通载体)而不表达目标蛋白。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利用甲基营养型酵母进行蛋白质表达 Pichia pastoris 作为一种宿主系统在本方案中进行了描述。该蛋白可根据所使用的克隆载体分泌至培养基中。重组蛋白的分泌可简化后续纯化步骤。然而,所示条件可能需要针对不同蛋白的表达进行优化,条件及表达时间的改变可能会提高蛋白表达水平。本方案所用载体具有以下特征: c-myc 表位以及针对该表位的抗体均可购得。这使得研究人员能够分析目前尚无可用抗体的蛋白质。亲本载体上的His标签特性可实现蛋白质在金属螯合树脂上的纯化,且已有针对该载体His标签区域的抗体可供使用。

如本实验方案所述,在Pichia pastoris中进行蛋白表达是一个多步骤的过程,需要周密的规划和准备。完成所有步骤需要两到三周的时间(不包括目的基因表达载体的克隆时间)。成功转化P. pastoris的基础在于使用具有高转化效率的感受态酵母细胞,以及能够整合到酵母基因组中的线性化表达载体。Western blot分析和His标签纯化可用于检测重组蛋白的表达水平,是完成本方案后需进一步进行的后续实验步骤。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢加拿大创新基金会、不列颠哥伦比亚知识发展基金以及加拿大卫生研究院(CIHR)对本工作的支持。M.T. 获得了由TULA基金会资助的微生物多样性与进化研究中心(CMDE)提供的博士后奖学金支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

参考文献

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cereghino, G. P., Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).
  2. Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
  3. Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).
  4. Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

AOX1 Zeocin c myc 6xHis Western

相关文章