使用宿主转移法对Xenopus oocytes进行受精

摘要

通过宿主转移法使Xenopus oocytes受精的操作步骤。

摘要

研究母源遗传分子对脊椎动物早期发育的贡献，常常受限于产生母源效应突变动物所需的时间和高昂成本。此外，在Xenopus和斑马鱼等生物中，许多用于过表达或抑制基因功能的技术难以有效靶向关键的母源信号通路，例如Wnt信号通路。在Xenopus中，通过在体外培养卵母细胞并对其进行基因功能操控，随后使其受精，可在一定程度上缓解这些问题。具体而言，从供体卵巢组织中人工去除滤泡细胞获得卵母细胞，在培养过程中按需进行注射或处理，然后用孕酮刺激以诱导其成熟。接着，将这些卵母细胞植入排卵宿主雌蛙的体腔内，它们会经由宿主的输卵管转运，并获得受精所必需的修饰和胶状包被。随后可将获得的胚胎培养至目标发育阶段，并分析任何实验干预所产生的效应。这种宿主转移方法在揭示早期发育基本机制方面已表现出极高有效性，并提供了其他任何脊椎动物模型系统所不具备的广泛实验可能性。

方案

1. 卵巢组织的手术切除

1. 准备新鲜批次的卵母细胞培养基（OCM；参见材料部分），根据实验规模准备400–800 mL。调节pH至7.6–7.8，直至酚红变为深红色（约加入5N NaOH六滴）。倒出少量培养基至另一试管中检测pH值，以避免pH电极污染培养基。OCM应储存于18°C，一周内使用完毕。
2. 选取3–5只雌性个体，将其中一只置于约2L缓冲麻醉液中（参见材料部分）。我们尽量避免使用在手术当天或前一天喂食过的蛙。在蛙逐渐进入麻醉状态的同时，用70%乙醇对手术区域进行消毒，并准备好手术器械。
3. 将手术器械在250°C的高温珠灭菌器中浸没20秒以完成灭菌。应准备以下器械：手术刀柄（#3）及刀片（#10或#11）、数对Dumont镊子、Bonn虹膜剪（弯型或直型）、Halsey或Olsen-Hegar显微持针器以及缝合线。将灭菌后的器械放置于无菌培养皿内或缝合线包装内部以维持无菌状态。开始前，将针夹持于持针器中并调整至合适方向。我们更偏好使用Olsen-Hegar持针器，因其手柄内置剪刀刃口，可在不更换器械的情况下修剪缝线。
4. 10分钟后检查是否达到外科麻醉深度。麻醉成功的蛙将停止活动，且对脚趾夹捏或翻转体位无反应。麻醉效果可持续约15分钟，足以完成全部手术操作。穿戴适当的手术防护装备，包括洁净手套（非乳胶）、实验服和外科口罩，具体选择依据个人习惯及所在机构的动物护理指南而定。
5. 关于无菌技术的说明：蛙类皮肤分泌物含有抗菌肽，通常可降低手术过程中污染的发生率，但仍应尽可能遵循无菌操作原则。可使用手术巾，但部分机构IACUC可能不要求，且实际益处有限。通常采用“尖端接触法”，即操作者的手仅接触器械尖端、缝线材料或切口部位。皮肤切开后可再次将器械放入珠灭菌器中灭菌，并在实验台上保留一个无菌区域用于放置器械（如培养皿或缝合线包装）。不同机构的要求可能存在显著差异，因此请务必遵循所在机构的指导方针，并在实施手术前接受适当培训。
6. 将蛙从麻醉液中取出，背位仰卧于湿润的手术擦拭布上。注意：可用稀释的聚维酮碘（1:20）或氯己定（0.75%）冲洗清洁皮肤。但应避免使用市售外科擦洗剂、肥皂及70%异丙醇，因其会损伤两栖动物娇嫩的皮肤。
7. 使用手术刀或小型虹膜剪，在腹部中线下方侧方位置做一小切口（1–1.5 cm）。同一蛙体上的后续切口应交替选择左右两侧，且彼此保持足够间距。切口方向可平行或垂直于中线。
8. 皮肤与腹肌切口应分两步进行。皮肤切开后，用镊子提起肌肉层及其周围白色的筋膜组织，然后在抬高的肌肉上做切口。使用剪刀垂直向下剪开，尽量一次快速完成切割，以暴露体腔并形成整齐的伤口边缘。若仅切断筋膜，其会回缩，增加缝合难度。提起肌肉有助于避免意外损伤内脏器官。同时，应尽量避免切断肌肉层中可见的淋巴心或血管。可用剪刀适当延长切口长度，以便卵巢组织顺利拉出。
9. 切开后卵巢应清晰可见。获取卵巢时，用镊子夹住并外翻卵巢组织。在贴近体壁处切除所需量的组织，并将其修剪整齐。切勿将组织重新塞入体腔，以免引发感染或其他并发症。
10. 立即在解剖显微镜下观察一小块卵巢组织，并剥离数个卵母细胞以检测其质量。卵母细胞应质地坚实，大小和色泽均匀一致。若质量合格，则取出所需量的卵巢组织并缝合切口。通常填满一个90 mm培养皿的量已足够大多数实验使用。若卵母细胞质量存疑，则先行缝合，更换另一只雌性个体重复操作。
11. 缝合切口时，应先缝合肌肉层和筋膜层。将针从切口外侧数毫米处进针，确保穿透筋膜层。仅缝合肌肉可能导致组织撕裂或缝线松脱。可用镊子辅助从切口对侧下方将针穿出。释放持针器后，从体外重新夹持针体，将缝线拉出，留出数英寸线尾，注意不要将整根线完全拉出。
12. 采用间断缝合法关闭伤口。我们使用基本的器械打结法制作外科方结（平结）。将缝线长端绕持针器一圈，用其夹住线尾并向自己方向拉过线环并收紧；再绕一圈并同法拉紧，但第二次拉动方向为远离自己；为增强牢固性，可再加第三道结（方向与第一道相同）。剪断缝线，留短小线尾，并在肌肉层距前一针数毫米处打下一针。小切口使用两针即可，大切口需三针。皮肤层缝合同理重复操作。基础缝合技术的视频演示可在YouTube上搜索“instrument tie”找到，虽有多种版本，但基本技术相同。
13. 用去离子水冲洗雌蛙体表，将其放入盛有冷水（18°C）的恢复桶中。在实验室期间，蛙类饲养于经Amquel处理以去除氯胺的自来水。每隔几分钟轻轻将蛙从水中提起，观察是否有吞咽动作或眼球突出等麻醉复苏迹象。
14. 注意：获取卵巢组织并非必须进行存活手术，尽管雌蛙在多次手术后仍可持续产出优质卵母细胞。实施存活手术还可减少实验动物使用数量。请务必遵循所在动物护理单位关于脊椎动物存活手术方法、术后护理与监测以及个体允许接受手术次数的相关规定。

2. 卵母细胞的培养与去滤泡

1. 手术结束后立即把卵巢分割成小块（约 2 cm²），每 90 mm 培养皿中放入 5–6 块，并用新鲜的 OCM 储存。将卵巢的各个叶切开，展平后切成方形小块。用干净的 OCM 冲洗这些组织块，然后放入培养皿中进行培养。展平并分割卵巢可延长其在体外培养中的存活时间，并使去滤泡操作更加容易。
2. 将一块卵巢组织转移至盛有 OCM 的小培养皿中，手动去滤泡 300–500 个卵母细胞。使用无菌的火焰抛光移液管转移卵母细胞。我们发现，使用带棉塞的移液管对最大限度减少培养污染至关重要。将卵母细胞以每组 100–150 个的形式储存在 8 mL OCM 中（置于 Falcon 1007 型中号培养皿），并在 18°C 下保存。经过练习后，通常可在 1–2 小时内完成足够数量的去滤泡操作。经胶原酶处理的卵母细胞不适合用于宿主移植，因其无法受精。
3. 去滤泡方法。我们使用钟表匠镊子（Dumont #4 或 #5，Fine Science Tools）进行去滤泡操作，基本方法参照 Smith et al.（1991）所述。用一只手（主用手）持一对镊子，夹住靠近滤泡与卵巢连接处（即柄部）的成熟 VI 期卵母细胞周围的卵泡膜结缔组织层；用另一对镊子夹住邻近第一对镊子位置的卵巢组织。轻轻横向撕开滤泡层，将卵母细胞从组织中轻柔地分离出来。成功去滤泡的卵母细胞比未去除滤泡层而直接拉出的卵母细胞更柔软，且无可见的血管结构。
4. 注意：操作镊子时必须保持极轻的夹持力度，仅使镊尖轻微接触即可。初学者常因用力过猛而导致卵母细胞连同完整的滤泡被拉出。应专门保留一对性能良好的镊子用于去滤泡操作，其尖端需精确闭合，且略钝于用于制备 Xenopus 胚胎外植体的镊子（见图 1）。
5. 我们通常使用孕酮对约 20 个卵母细胞进行成熟能力测试，若成熟率较低（室温下 6–7 小时后成熟率<50%），则中止实验。
6. 至此，可根据实验需求对卵母细胞进行操作和培养，例如寡核苷酸、吗啉代寡核苷酸或 mRNA 的显微注射。不同实验室的注射程序可能存在差异，此处不再详述。卵母细胞可在 OCM 中维持培养长达一周，但其健康状态通常会逐渐下降，因此建议在分离后 96 小时内用于移植实验。
7. 需注意，由于活性染料的使用限制，每只雌性个体最多只能移植五个到六组样本（包括对照组），请据此合理规划实验设计。

3. 卵母细胞成熟及潜在宿主雌性动物的刺激

1. 若进行寡核苷酸耗竭的挽救实验，需在寡核苷酸注射后约 24–48 小时注射 mRNA（通常为 50–300 pg RNA）。此时寡核苷酸已降解，不会影响注射的 mRNA。
2. 在进行移植的前一晚，向含 8 mL OCM 的培养皿中的卵母细胞加入 16 μL 孕酮工作液（1 mM 溶于乙醇），使孕酮终浓度约为 2 μM。于 18°C 培养 10–12 小时，以促进卵母细胞成熟。
3. 每只雌蛙注射 1000 单位 hCG，共注射 3–5 只，以诱导产卵。实验结果表明，若卵母细胞成熟处理与 hCG 注射时间相近，约在移植入宿主前 12 小时进行（例如晚上 10 点至次日上午 10 点），效果更佳。将雌蛙于室温或 18°C 过夜孵育。

4. 卵母细胞的准备与活体染料染色

1. 在移植当天早晨，预留约 45–60 分钟用于准备和执行操作。此时，成熟的卵母细胞可冷冻保存，以便后续分析 mRNA 沉默效率或蛋白表达水平。同时，检查卵母细胞是否发生感染，并确认成熟率良好（>50%）。受感染的卵母细胞无法受精。将活性染料（试剂）解冻，并以最高速度离心 5 分钟。
2. 通过向卵母细胞培养皿中加入 80 μL 相应的活性染料，对不同实验组进行染色，并在摇床上孵育 15 分钟。在此期间，选择一只宿主雌性并开始麻醉。选择正常缓慢产卵或经轻微挤压即可大量排卵的蛙。宿主所产卵应具有较高质量。避免选用产出卵串或破碎卵的雌性。
3. 将染色后的卵转移至盛有新鲜 OCM 的大培养皿中，轻轻旋转洗涤片刻，随后放置一旁，待移植时使用。
4. 准备一支无菌巴斯德吸管，其内径应刚好能容纳一个卵母细胞（约 1.5 mm），用于卵母细胞移植。使用金刚石笔在吸管上划痕后折断，再进行火焰抛光，使边缘光滑，注意避免熔化导致管口封闭。

5. 进行卵母细胞移植

1. 卵母细胞移植采用与第一部分所述相同的手术步骤，只是不摘除卵巢，而是用移液管将经处理的卵母细胞引入体腔。理想情况下，移植操作应尽快完成，切口应尽可能小。
2. 按照第一部分所述方法对宿主雌性进行麻醉，并准备手术器械。按照第一部分所述制作切口。切口可以更小，但必须足够大以容纳移植移液管的管腔（图2A）。
3. 进行卵母细胞移植时，用镊子夹住并提起一块肌肉和筋膜瓣，使用上述制备好的巴斯德移液管将实验用卵母细胞导入。轻轻旋转盛有卵母细胞的培养皿，使其聚集于中央，尽可能多地吸取卵母细胞。让卵母细胞沉降至移液管末端，以防止吸入过多液体，然后将移液管尖端插入切口，缓慢释放卵母细胞，使其缓缓流入体腔（图2B）。重复此步骤，直至所有卵母细胞均被转移。在整个操作过程中，切勿松开肌肉层，直到开始缝合为止，否则卵母细胞会从切口溢出。
4. 完成卵母细胞转移后，用镊子夹住切口两侧并将其对合，使卵母细胞沉入体腔内。按照前述方法开始缝合，注意在打第一个结之前始终保持对肌肉和筋膜向上的张力（图2C）。这可防止卵母细胞被挤出，并有助于切口边缘均匀愈合。在肌肉/筋膜层再加一针缝合，然后缝合皮肤。
5. 用去离子水冲洗雌蛙，将其放入盛有冷却（18°C）且经Amquel处理过的水的恢复桶中。按上述方法监测其从麻醉中恢复的情况。术后她应能正常产卵。
6. 按照常规方法获取雄性青蛙的睾丸。将睾丸保存在OCM或L15培养基中，待用时取出。我们在进行移植受精实验时更倾向于使用新鲜的睾丸组织。

6. 卵母细胞的回收与 体外 受精

1. 腹腔纤毛会将移植的卵子（以及宿主正常的体腔卵）驱动至体腔前部的输卵管开口处。移植后2-3小时即可通过常规挤压回收有色卵子。每隔约半小时可收集一次卵子，直至雌蛙停止产卵。
2. 在精子悬浮液（约4 mL 1x MMR）中受精4分钟。用0.1x MMR大量冲洗并换液。卵子应正常激活，并在受精后约1.5-2小时开始卵裂。移植的卵子通常比宿主卵子稍晚开始卵裂。
3. 常规使用半胱氨酸去除胶状膜，并将胚胎分拣至不同的培养皿中。此步骤可根据实验需求在任意阶段进行。通常在4细胞期左右最容易识别不同颜色，而在晚期囊胚阶段最难分辨。将卵子以低密度（< 每个中等培养皿50个）在洁净的0.1x MMR中培养。此后可对胚胎进行常规处理和操作。
4. 将青蛙送回动物饲养设施，并在接下来的几天内监测是否出现并发症。
5. 替代受精方法：在高盐缓冲液中产卵
   1. 青蛙从麻醉状态恢复后，将其放入约1 L的高盐MMR（1.2x）中。让雌蛙在缓冲液中产卵约4-6小时。挤出剩余卵子，弃去1.2x MMR，将有色卵子分拣至洁净培养皿中，并尽可能去除所有液体。
   2. 用0.3x MMR充分洗涤，然后在最小体积的0.3x MMR/精子悬浮液中受精，直至卵子激活（10分钟）。随后用0.1x MMR淹没并按上述方法培养。若需要大量处于相同发育阶段的卵子，或手动挤卵可能损伤供体卵母细胞时，此方法尤为适用。

讨论

成功的转移将导致受精及正常的卵裂 > 50%的卵母细胞（图3）。通常，移植的卵母细胞中有30–60%可存活至神经胚阶段。我们通常每个实验组移植75–150个卵母细胞，足以获得用于多种分析（原位杂交、RT-PCR）以及表型观察的胚胎数量。显著增加移植卵母细胞数量似乎并不能明显提高收获率。此外，为确保至少部分胚胎能够通过原肠胚形成阶段，每组应至少移植30个卵母细胞。在本方案所述的浓度和条件下，活体染料通常不会对胚胎产生影响，尽管在某些情况下染料可能具有不良效应。经典研究表明，中性红在强钨光源照射下具有光毒性。最近，Mir和Heasman（2008）报道，若胚胎在低温条件下孵育，俾斯麦褐可能产生一定毒性作用。采取基本预防措施，例如避免过度染色卵母细胞，以及避免温度和光照的极端条件，即可消除活体染料产生副作用的可能性。

影响该方法成败的最重要因素是供体卵母细胞和宿主雌性的质量。目前尚无万无一失的方法来判断某一批卵母细胞是否能良好受精。应避免使用萎缩性卵母细胞比例较高的卵巢。此外，我们发现血管化程度较高的卵巢受精效果较差，这可能表明正在发生组织重吸收。卵母细胞应尽可能保持在18°C，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
溶液与配方：
OCM（卵母细胞培养基；改良自Wylie） 等., 1996)
70% Leibovitz’含L-谷氨酰胺的L-15培养基（s L-15 medium）	Invitrogen	11415-064
0.4 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA；第五组分）	Sigma-Aldrich	A-9418-50g
1× 青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P-0781
用 5N NaOH 调节 pH 至 7.6–7.8
每周新鲜配制，储存于18°C.
10X MMR（Marc’改良型林格液’s 溶液；Zuck 等., 1998)
1 M NaCl
20 mM KCl
20 mM CaCl2
10 mM MgCl2
150 mM HEPES
调节pH至7.6-7.8
4°C 下保存°C
麻醉溶液
1 g/L 3-氨基苯甲酸乙酯（MS222）	Sigma-Aldrich	A-5040
0.7 g/L 碳酸氢钠
在经Amquel处理的水中溶解
每周新鲜配制
孕酮储备液
10 mM 孕酮（Sigma P-0130）溶于100%乙醇
用100%乙醇稀释至1 mM，配制500倍储备液/工作液
-20℃保存°C
活体染料（改良自 Heasman） 等., 1991)
蓝色：0.1% 尼罗蓝A	Aldrich	121479-5G
红色：0.25% 中性红	Sigma-Aldrich	N-6634
棕色：1% 比斯马克棕	Sigma-Aldrich	B-2759
绿色（80 μl 蓝色 + 80 μl 棕色),
Mauve（80 μl 蓝色 + 80 μ红色。
第六种颜色，橙色（80 μl 红+ 80 μl 棕色）也可使用，但通常难以与棕色区分。
蓝色、红色和棕色储备液在50 ml离心管中用去离子水配制，室温下摇动孵育20分钟，随后在临床离心机中离心。上清液分装至微量离心管中，于-20 ℃保存。°C.