非洲爪蟾胚胎的组织者与动物极外植体解剖及细胞黏附实验的构建

摘要

本视频演示了从非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎中制备组织中心区和动物极外植体的技术，包括使用眉刀——一种由眉毛制成的专用解剖工具。同时提供了黏附力检测实验的方案，用于检测组织中心区或动物极细胞表面是否存在对正常发育至关重要的关键黏附分子。

方案

准备黏附腔（注射/解剖前一天）

黏附实验腔室

如果使用的是传统复式显微镜（光学系统位于载物台上方），则需要制作一个低高度的黏附腔，步骤如下。如果使用倒置光学显微镜，则可直接使用“NUNC Lab-Tek 带腔室的盖玻片”， 并跳过步骤 #1 - 2。

1. 将一个“按压密封硅绝缘体”贴附到 40 × 24 mm 的盖玻片上。在洁净台面上用力按压绝缘体使其牢固粘附于盖玻片，并从另一侧检查，确保绝缘体完全贴合且无任何气泡。
   
   
2. 可选步骤：将粘附室放入带有 Whatman 滤纸的玻璃培养皿中，使用干热循环高压灭菌法进行灭菌，随后冷却至室温。

包被腔室

1. 使用经 Sigmacoat 处理的黄色枪头，将 200 µL 工作浓度的钙黏蛋白溶液（10 mg/mL）或纤连蛋白溶液（20 mg/mL）滴加至灭菌后的黏附腔中央。室温孵育 4 小时。
   
   
2. 吸出钙黏蛋白或纤连蛋白溶液，并转移至 1.5 mL 离心管中。该溶液可在接下来的两周内重复使用。
   
   
3. 加入 500 µL 含 4% BSA 的 1× MBS-H 溶液以封闭黏附腔。室温孵育 1 小时。
   
   
4. 吸除 BSA 溶液，用 500 µL 1× MBS-H 溶液洗涤黏附腔两次。第二次洗涤后，吸出大部分 MBS-H 溶液（不要完全吸干），并将黏附腔置于密封容器中，4 °C 保存。该黏附腔可在接下来的 2–3 天内使用。

动物帽外植体的解剖与解离

1. 将已注射的胚胎孵育在0.1x MBS-H中，该溶液由经高压灭菌的1x MBS-H稀释而来，因为未经高压灭菌的培养基有时可能携带少量微生物，会干扰动物帽细胞的解离。
   
   
2. 使用60 mm培养皿制备1x Barth's琼脂糖平板和CMF-MBS琼脂糖平板，数量至少与样本数相同。向1x Barth's平板中加入高压灭菌的1x MBS-H。对于CMF-MBS平板，每皿加入10 ml CMF-MBS。
   
   
3. 当胚胎发育至8.5期时，在1x Barth's平板中开始分离动物帽组织。每个样本通常取10–15个外植体即可满足实验需求。
   
   
4. 将动物帽外植体转移至CMF-MBS平板中，在45–60分钟内孵育，直至外植体完全解离。每隔15分钟轻轻振荡一次，有助于促进解离过程。

细胞黏附实验

1. 接种细胞：向上述步骤中准备好的黏附腔内加入500 ml的1× MBS-H， 粘附实验小室的制备及小室包被。使用P200移液器配合经sigma涂层处理并剪去末端的黄色吸头，将解离的动物帽细胞从CMF-MBS培养板转移至粘附实验小室中。
   
   
2. 可选： 如果可能，小心吸去约三分之二至一半的培养基，避免细胞暴露于空气中。加入大致等量的新鲜 MBS-H，以确保培养基中含有足够的 Ca²⁺ 和 Mg²⁺.
   
   
3. 室温孵育45至90分钟。期间定期观察细胞，以确认其是否已贴附于培养容器底部表面。
   
   
4. 现在可以在显微镜下拍摄细胞的图像。
   
   
5. 将粘附室置于网格载玻片上，使粘附室的一个角与网格载玻片的角对齐。在多个不同的网格中计数并记录粘附细胞的数量。
   
   
6. 将1升MBS-H倒入一个大型塑料桶中（例如Tupperware等）。轻轻将黏附载玻片室置于桶底，在50–60 rpm的低速条件下于旋转摇床上旋转5分钟。
   
   
7. 将粘附室放回网格载玻片上，使粘附室的同一角落与网格载玻片的相应角落对齐，操作方式与之前一致 在本节第5步，即细胞黏附实验中，计数在清洗前已计数过的同一网格中仍保持附着的细胞数量。计算清洗后仍保持附着的细胞百分比。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x MBS-H	缓冲液			改良巴思法’s 培养基：1 L 配方：5.14 g NaCl，75 mg KCl，0.2 g NaHCO₃3 0.2 g MgSO₄4•7H2O 60 mg CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O238 g HEPES（游离酸），用 NaOH 调节 pH 至 7.4，高压灭菌。
CMF-MBS	缓冲液			这是 Ca2+/毫克2+无MBS-H版本。500 mL配方：2.57 g NaCl，37.5 mg KCl，0.1 g NaHCO₃3/3> 1.19 g HEPES（游离酸），用 NaOH 调节 pH 至 7.4，高压灭菌。
1% 琼脂糖/1x Barth 溶液’平板				与样本数量相同
1% 琼脂糖/CMF-MBS 平板				与样本数量相同
E-钙黏蛋白/Fc嵌合体	试剂	Sigma-Aldrich	E-2278	将0.1 mg固体E-cadherin溶于100 μl含40%甘油的1× MBS-H缓冲液中，配制成100倍母液（1.0 mg/ml）。储存于 –20 °C. 使用前，用1× MBS-H缓冲液进行100倍稀释，配制成10 μg/ml的工作液。每个样品需要200 μl该工作液。
纤连蛋白，0.1% 溶液	试剂	Sigma-Aldrich	F-1141	该预配溶液可用作50倍浓缩液。用1x MBS-H稀释50倍以制备20 μg/mL 工作液，使用前配制。你需要 200 μ每份样品使用该工作溶液 L。我不建议使用固态纤连蛋白，因为在制备储存液时，很难将其溶解至 0.1% 的浓度。尽管预制成的 0.1% 溶液成本较高，但更有利于获得稳定一致的实验结果。
4% BSA /MBS-H	缓冲液			BSA：分子生物学级第V组分
Sigmacoated 黄色吸头	工具
1 号盖玻片				40 mm × 24 mm 或 60 mm × 24 mm
按压密封硅绝缘体	工具	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2.5 mm 深度 × 20 mm 直径
NUNC Lab-Tek 培养皿式载玻片	工具	Fisher Scientific	12-565-471	2 个孔/载玻片
网格载玻片	工具			或用于细胞计数的Finder网格