应用停流动力学方法研究DNA修复蛋白作用机制

摘要

Msh2-Msh6 负责启动 DNA 复制错误的修复。本文介绍了一种瞬时动力学方法，用于理解这一关键蛋白的作用机制。该报告展示了停流实验，用于测量 Msh2-Msh6 在 DNA 修复中偶联的 DNA 结合与 ATP 酶动力学过程。

摘要

瞬态动力学分析对于理解生物大分子的作用机制至关重要，因为该方法能够提供有关活性位点浓度和调控大分子功能的本征速率常数等机理信息。以酶为例，瞬态或预稳态测量可识别并表征反应途径中的各个独立事件，而稳态测量仅能获得整体催化效率和特异性。诸如蛋白质-蛋白质或蛋白质-配体相互作用以及限速构象变化等独立事件通常发生在毫秒时间尺度内，可通过停流法和化学淬灭流动法直接测定。当存在荧光等光学信号时，停流法是一种强大且易于实施的工具，可用于监测从底物结合、产物释放到催化循环的整个反应进程^1,2。

本文报道了采用停流动力学方法研究Msh2-Msh6的作用机制，Msh2-Msh6是一种真核DNA修复蛋白，可识别DNA中的碱基错配和插入/缺失环，并启动错配修复（MMR）^3-5。通过这一过程，Msh2-Msh6可将DNA复制的准确性提高三个数量级（错误频率从约~10^-6降至10^-9个碱基），从而有助于维持基因组的完整性。毫不意外的是，人类Msh2-Msh6功能缺陷与遗传性非息肉病性结肠癌及其他散发性癌症相关^6-8。为了深入理解这一关键DNA代谢蛋白的作用机制，我们正在研究Msh2-Msh6与错配DNA相互作用的动力学过程，以及为其在错配修复中的功能提供能量的ATP酶活性。DNA结合通过将Msh2-Msh6与含有邻近G:T错配的2-氨基嘌呤（2-Ap）荧光探针的DNA快速混合，并实时监测2-氨基嘌呤荧光强度的增加来测定。DNA解离则通过将预先形成的Msh2-Msh6与G:T(2-Ap)错配复合物与未标记的捕获DNA混合，并监测荧光随时间下降的过程来测定⁹。前期稳态ATP酶动力学通过检测7-二乙氨基-3-((((2-马来酰亚胺基)乙基)氨基)羰基)香豆素标记的磷酸结合蛋白（MDCC-PBP）在结合Msh2-Msh6水解ATP后释放的无机磷酸盐（Pi）时荧光信号的变化来测定^9,10。

实验数据表明，Msh2-Msh6 能快速结合 G:T 错配，并形成寿命较长的 Msh2-Msh6-G:T 复合物，进而抑制 ATP 水解，使蛋白稳定在 ATP 结合状态。反应动力学结果明确支持以下假说：当 ATP 结合态的 Msh2-Msh6 识别双螺旋中的错配碱基对时，会发出 DNA 修复信号。

F. Noah Biro 和 Jie Zhai 对本论文贡献相同。

方案

A. Msh2-Msh6 DNA 结合动力学的测定

1. Msh2-Msh6 DNA 结合动力学实验的样品准备

在停流装置上进行基于荧光的动力学DNA结合实验时，试剂的准备与在荧光分光光度计上进行平衡结合实验时类似。实际上，应首先进行平衡结合分析，以估算相互作用的解离常数（K_D），从而为动力学分析优化反应条件。与平衡或稳态实验相比，停流实验需要更多的生物材料；因此，当可获得毫克量级的蛋白质且能够制备或购买类似数量的配体时，该方法最为可行^11,12。

1. 我们在大肠杆菌（E. coli）中过表达酿酒酵母（S. cerevisiae）Msh2-Msh6蛋白，并通过离子交换色谱法纯化获得毫克级蛋白（图1）¹¹。
2. 含或不含2-氨基嘌呤荧光团的DNA试剂均可通过化学合成获得。我们购买经2-氨基嘌呤修饰的37个核苷酸长度的单链DNA，并将两条互补链退火，以制备在G:T错配位点邻近含有2-氨基嘌呤的双链DNA（图2）。DNA可由生产商纯化，也可在实验室通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化；后者通常可获得更高的产率。
3. 进行DNA结合动力学实验时，分别在DNA结合缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，5 mM MgCl₂，100 mM NaCl）中配制G:T(2-Ap) DNA和Msh2-Msh6蛋白样品。Msh2-Msh6和DNA的浓度分别为0.8 μM和0.12 μM，在1:1混合比例的单次混合实验中，最终浓度分别为0.4 μM和0.06 μM。进行DNA解离动力学实验时，配制一份含0.8 μM Msh2-Msh6和0.12 μM G:T(2-Ap) DNA的样品，另配制一份含8 μM未标记G:T DNA的样品作为游离Msh2-Msh6的捕获剂。将样品配制后置于冰上保存。在这些反应中，蛋白浓度远高于Msh2-Msh6与DNA相互作用的10 nM K_D值，而DNA浓度足以产生较强的荧光信号（经经验确定）。每份样品准备400 μl体积，足以获得约10条动力学曲线（表1）。
4. 在蛋白、DNA和缓冲液的配制过程中，应使用不含荧光杂质的高纯度化学试剂。所有缓冲液均需经0.2 μm滤膜过滤，以防止微粒堵塞停流装置。
5. 若荧光团可吸收可见光，则样品制备和实验操作必须在避光条件下进行。

2. Msh2-Msh6 DNA结合动力学实验的仪器准备

停流仪的原理相当简单。它利用驱动马达将两个驱动注射器中的溶液快速推入混合装置，混合后的溶液随后流入观测池以进行数据采集（图3）。我们使用的是KinTek停流仪，该仪器所需样品体积小，支持反应物的单次或连续混合，可检测多种光学信号，且操作非常简便。其他多家制造商也提供停流仪设备。

1. 为了准备停流仪进行实验，确保计算机和控制器处于关闭状态。开启循环水浴并设置为室温（25 °C），以冷却光源。点燃光源。将单色仪设置为所需的激发波长（如使用2-氨基嘌呤时为315 nm）。旋转狭缝转轮至所需的狭缝宽度（需根据经验平衡高荧光激发与低光漂白）。打开控制器和计算机。开启循环水浴，使水流经夹套以在实验过程中将反应物维持在所需温度（30 °C）°C 在以下情况下 S. cerevisiae Msh2-Msh6
2. 接下来，运行停流程序。开启所选的检测器，在本例中为配备适合荧光染料的干涉滤光片的光电倍增管（PMT）（若使用2-氨基嘌呤，则采用350 nm截止滤光片）。对PMT施加电压。测量暗电流以校正任何背景电噪声。
3. 停止流动驱动注射器和观察池在加载样品前必须进行清洗。将样品加载阀置于LOAD位置。用去离子过滤水填充1 ml注射器，将其连接至驱动注射器下方的加载端口，手动推动水在两个注射器之间循环数次。对实验中将使用的每个驱动注射器重复此过程两次。接下来，用去离子水填充驱动注射器以清洗观察池。将样品加载阀切换至FIRE位置。使用调节注射器驱动命令（控制驱动电机），降低驱动板，使水通过观察池进入出口管路。注意不要将驱动注射器的推杆完全推至末端。随后提升驱动板，将阀门切换回LOAD位置。手动用反应缓冲液清洗注射器，并保持排空状态。仪器现已准备就绪，可供使用。

3. Msh2-Msh6 DNA 结合实验与数据分析

1. 将每个样品从离心管转移至一支新的1 ml注射器中。将各样品注射器连接至加样口，并将溶液推入驱动注射器。通过手动在两个注射器之间反复推动溶液并间歇暂停数次，仔细排除所有气泡。降低驱动板，直至其接触驱动注射器顶部。让反应物在室温下平衡数分钟。
2. 进行数据采集时，打开“设置时间/通道”窗口，选择数据采集通道（PMT）、数据分析模式（荧光）以及要采集的轨迹数量（ Shots ）。输入数据采集时间，在此期间将采集1000个数据点。对于未知反应，应监测数秒以检测是否存在缓慢反应相。根据经验估计达到平衡或稳态所需的时间，并将数据采集时间设置为 ≥ 6个半衰期。以Msh2-Msh6为例，G:T错配结合动力学的最佳时间为2秒，G:T解离动力学为60秒。现在将阀门置于FIRE位置，然后点击“采集数据”按钮。此操作将启动Msh2-Msh6与DNA的混合，使反应进入观察池，激发2-氨基嘌呤荧光探针，并随时间收集荧光信号。至少采集5条动力学曲线以获得高质量数据，并保存文件。
3. 实验完成后，关闭光源。按照前述方法用水清洗注射器和观察池。然后关闭其余设备，循环水浴除外。继续循环水流15分钟，以冷却光源。
4. 可使用KinTek软件本身进行数学运算和数据拟合，以便在实验过程中初步了解反应动力学特征。进一步分析可通过平均多条动力学曲线，将平均后的文件保存并导出至其他数据分析或作图软件中完成。

4. Msh2-Msh6 DNA 结合动力学的代表性结果

G:T错配DNA与Msh2-Msh6相互作用的动力学数据可拟合为单指数函数，并得到一个快速结合速率常数 k_开启 接近 3 x 10⁷ M-1·s-1（图4A）和一个缓慢的解离常数 k_关闭 0.012 秒^-1 （图4B），表明Msh2-Msh6能够快速结合G:T错配，并形成一个非常稳定的复合物，其半衰期接近60秒 ¹³.

B. Msh2-Msh6 ATP酶动力学的测定

1. Msh2-Msh6 ATP酶动力学实验的样品制备

1. 按照前述方法制备Msh2-Msh6蛋白和DNA试剂，使用未标记的DNA。此外，从E. coli中纯化磷酸盐结合蛋白（Phosphate Binding Protein, PBP），并用MDCC荧光团对其进行标记（图5）^14,15。MDCC-PBP可快速结合游离磷酸盐（k_ON = 1 × 10⁸ M^-1秒^-1），且具有高亲和力（K_D = 100 nM），从而引起MDCC荧光的显著增强（图6）。因此，MDCC-PBP是检测稳态前ATP水解及磷酸盐释放动力学的可靠报告分子^14,15。需注意，本实验中必须尽量降低背景磷酸盐水平；因此，在试剂制备的**所有**阶段都应严格避免使用玻璃器皿。
2. 准备一个含有4 μM Msh2-Msh6蛋白的样品，可选择性加入6 μM G:T DNA，经1:1比例混合后，最终浓度分别为2 μM和3 μM。需注意，稳态前实验需要较高的酶浓度，因为所检测的信号来源于单次或最初几次催化循环。另准备一个含有1 mM新配制ATP和20 μM MDCC-PBP报告分子的样品。向样品中加入0.10 Units/ml的嘌呤核苷磷酸化酶以及200 μM 7-甲基鸟苷，以清除可能存在的磷酸盐污染。将样品置于冰上孵育至少20分钟（表2）。

2. Msh2-Msh6 ATP酶动力学实验的仪器准备

1. 按照先前所述方法准备停流仪以进行实验。此外，使用 0.5 Units/ml 嘌呤核苷磷酸化酶和 200 μM 7-甲基鸟苷在驱动注射器中清除磷酸盐污染物，处理 20 分钟。将激发波长设置为 425 nm，并在 PMT 检测 MDCC-PBP 荧光时使用 450 nm 截止滤光片。

3. Msh2-Msh6 ATP酶实验与数据分析

1. 按照前述方法将样品装入驱动注射器中。点击“采集数据”以混合 Msh2-Msh6 与 ATP 及 MDCC-PBP，并随时间监测 Msh2-Msh6 介导的磷酸盐释放以及与之偶联的 MDCC-PBP 荧光增强信号。至少采集 5 条动力学曲线以获得高质量的数据集，并保存文件。对多条动力学曲线进行平均处理，导出数据文件用于后续分析。
2. 制备标准曲线以确定磷酸盐浓度与MDCC-PBP荧光强度之间的线性关系。为此，在停流条件下，将MDCC-PBP与不同浓度的磷酸盐在相同的实验条件下混合，并测定每个磷酸盐浓度下的MDCC-PBP最大荧光强度。
3. 绘制 MDCC-PBP 荧光最大值 与 每种磷酸盐浓度用于标准曲线（图7），并利用斜率计算Msh2-Msh6反应中的磷酸盐浓度。绘制磷酸盐浓度 与 时间和数据拟合为指数函数和线性函数。该函数描述了反应中先出现的预稳态ATP水解和磷酸盐释放的爆发相，随后是反应的线性稳态阶段。

4. Msh2-Msh6 ATP酶动力学的代表性结果

动力学数据显示，Msh2-Msh6 在第一个催化循环中水解 ATP 并以 1.4 秒^-1 的速率快速释放磷酸盐。此阶段之后是反应中的一个缓慢步骤，使后续的催化循环受限，稳态下的 k_cat 降低至 0.2 秒^-1，比初始速率慢 7 倍（图 8A）。然而，当 Msh2-Msh6 结合错配 DNA 时，ATP 水解和磷酸盐释放的爆发相受到抑制，Msh2-Msh6 会更长时间地保持在 ATP 结合状态。

图1. 从 E. coli 中纯化 S. cerevisiae Msh2-Msh6 蛋白复合物。Msh2 和 Msh6 基因被克隆至 pET11a 载体中，并在 E. coli BL21 (DE3) 细胞中过表达。该蛋白复合物通过 SP-Sepharose、肝素和 Q-Sepharose 层析树脂进行柱层析纯化。此处展示的 SDS-PAGE 分析包含来自 Q-Sepharose 柱的蛋白组分。

图2. 互补的单链DNA退火形成双链，其中含有G:T错配，并在相邻位置含有腺苷（用于ATP酶实验）或腺苷的荧光碱基类似物2-氨基嘌呤（用于DNA结合实验）。

图3. 单次混合实验中，反应物在KinTek停流装置中的流动过程。

图4a. Msh2-Msh6与G:T错配相互作用的动力学。将含有邻近2-氨基嘌呤的G:T错配的双链DNA（0.12 μM）与Msh2-Msh6（0.8 μM）混合后，随时间推移荧光信号增强，得到该相互作用的双分子速率常数 kON = 2.4 × 10⁷ M^-1s^-1。

图4b. Msh2-Msh6与G:T错配的相互作用动力学。将预先形成的Msh2-Msh6/G:T(2-Ap)复合物与过量未标记的G:T DNA（8 μM）混合，后者可捕获任何游离的Msh2-Msh6，导致荧光随时间下降，得到缓慢的解离速率常数kOFF = 0.012 s^-1，表明该复合物稳定，半衰期长达约60秒。最终浓度：0.4 μM Msh2-Msh6，0.06 μM标记DNA，4 μM未标记G:T DNA捕获探针。

图5. MDCC-PBP 制备。对纯化后用 MDCC 荧光团标记的大肠杆菌（E. coli）磷酸盐结合蛋白（PBP）进行 SDS-PAGE 分析。

图6. MDCC-PBP 对磷酸盐的响应。用磷酸盐（Pi）滴定 MDCC-PBP 会导致 MDCC 荧光增强。

图7a. 磷酸盐（Pi）标准曲线的制备。将MDCC-PBP（20 μM）与不同浓度的Pi（0 - 8 μM）混合，并随时间测量荧光，直至达到平衡。最终浓度：10 μM MDCC-PBP，0 - 4 μM Pi。

图7b。 磷酸盐（Pi）标准曲线的制备。最大MDCC-PBP荧光强度绘制 与 [Pi] 以生成标准曲线。该直线的斜率（0.383） μM^-1 在此情况下，用于将 MDCC-PBP 荧光转换为 Pi 浓度。

图8a. Msh2-Msh6 ATP酶动力学。在无G:T DNA存在的情况下，将Msh2-Msh6（4 μM）迅速与ATP（1 mM）和MDCC-PBP（20 μM）混合，可观察到ATP水解和Pi释放的爆发相。数据分析得到爆发相的速率（k _hydrolysis = 1.4 s^-1）和幅度（2 μM；每个Msh2-Msh6分子有一个位点），随后进入线性稳态相，速率为0.4 μM s^-1（k_cat = 0.2 s^-1）。

图8b. Msh2-Msh6 ATP酶动力学。向反应体系中加入G:T DNA（6 μM）可抑制ATP水解的爆发相，使复合物稳定在ATP结合状态。最终浓度：2 μM Msh2-Msh6，500 μM ATP，3 μM DNA，10 μM MDCC-PBP。爆发相动力学通过以下方程拟合：[Pi] = A₀e-^kt + Vt，其中[Pi]为无机磷酸浓度，A₀为爆发相幅值，k为观测到的爆发速率常数，V为线性阶段的反应速度（k_cat = V/[Msh2-Msh6]）。

样品	蛋白质			DNA
试剂	储备液	工作液	体积，μL	储备液	工作液	体积，μL
Msh2-Msh6	5 μM	0.8 μM	64	-	-	-
2ApG:T	-	-	-	10 μM	0.12 μM	4.8
缓冲液	10x	1x	40	10x	1x	40
ddH2O	-	-	296	-	-	355
总计			400			400

表1 DNA结合反应

样品	蛋白			蛋白-DNA			ATP
试剂	储存液	工作液	体积, μL	储存液	工作液	体积, μL	储存液	工作液	体积, μL
Msh2-Msh6	20 μM	4 μM	80	20 μM	4 μM	80	-	-	-
G:T	-	-	-	100	6	24	-	-	-
ATP	-	-	-	-	-	-	50 mM	1 mM	8
7-MEG	250x	1x	1.6	250x	1x	1.6	250x	1x	1.6
PNPase	100x	1x	4	100x	1x	4	100x	1x	4
PBP-MDCC	150 μM	20 μM	53.3	150 μM	20 μM	53.3	-	-	-
缓冲液	10x	1x	40	10x	1x	40	10x	1x	40
ddH2O	-	-	221	-	-	197	-	-	346
总计			400			400			400

表2 ATP酶反应

讨论

文中所述的DNA错配结合蛋白示例说明了瞬态动力学方法在研究生物分子机制方面的强大功能和实用价值。在单次转换时间尺度上进行的停流测量，为Msh2-Msh6蛋白对错配碱基对的快速且特异性结合以及长寿命蛋白×DNA复合物的形成提供了明确证据⁹。此外，对ATP酶活性的停流（以及淬灭流）分析直接证明了Msh2-Msh6在结合错配DNA后转变为ATP结合构象^11,16。这一构象转换被认为可向DNA修复系统发出信号^17,18。此类高分辨率的动力学数据，结合互补的高分辨率结构数据，对于深入理解大分子功能至关重要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
37 G			DNA序列：5’- ATT TCC TTC AGC AGA TAT <强>G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3’
37 T（2-Ap）			DNA序列：5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA <强>TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3’
37 T			DNA序列：5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA <强>T A T ATC TGC TGA AGG AAA T-3’