移植表达GFP的卵裂球用于嵌合斑马鱼胚胎视网膜和脑发育的活体成像

摘要

我们演示了一种用于生成嵌合体斑马鱼胚胎的实验方案，以在胚胎发育过程中对细胞行为进行活体成像观察。

摘要

在胚胎发生过程中，细胞的位置和特性会发生广泛变化，这些变化受到细胞与其环境之间相互作用的调控。由不同遗传背景细胞组成的嵌合胚胎是研究目的基因介导的细胞间相互作用的有力工具。斑马鱼在早期发育阶段具有胚胎透明性，可在细胞水平上直接观察组织和器官的形态发生过程。本文介绍了一种在斑马鱼胚胎中生成嵌合视网膜和脑组织并进行供体细胞活体成像的实验方案。该方案包括移植针的制备、将表达GFP的供体卵裂球移植到不表达GFP的宿主胚胎中，以及利用活细胞共聚焦显微镜观察供体细胞的行为。通过适当调整，该方案也可用于研究斑马鱼其他组织和器官的胚胎发育过程。文中还讨论了使用GFP标记供体细胞的优势。 嵌合胚胎，斑马鱼，细胞移植，活体成像，共聚焦显微镜，GFP，视网膜，脑发育，胚胎发生，细胞间相互作用

方案

第1天。准备

1. 建立鱼类交配组合

在傍晚设置斑马鱼的成对交配。为防止在预期时间前发生随机交配，使用隔离板将交配盒中的雌鱼和雄鱼分隔开。表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因鱼用作供体卵裂球的来源。本实验所用的pt104转基因品系（Zou et al., 2008）在EF1启动子的调控下组成型表达GFP。GFP的表达使得通过活体成像可直观观察供体细胞。根据特定需求，也可使用其他表达合适荧光蛋白的转基因鱼品系。

2. 准备楔形琼脂糖加样孔以固定胚胎

将用E3胚胎水（Westerfield, 2007）配制的1%熔融琼脂糖倒入培养皿中。将带有楔形突起的塑料模具漂浮于琼脂糖溶液上，静置直至琼脂糖溶液完全凝固。小心移除模具，并用E3水浸没琼脂糖凝胶床。

3. 准备受精针

使用垂直式拉针仪（David KOPF Instruments），将功率设置为11.5，通过拉制玻璃毛细管移液器（World Precision Instrument）制备微针。理想的针尖应具有细长的锥形结构。使用显微研磨仪（Marishige）以45度角研磨针尖，直至获得内径为40–45 μm的斜面开口（图1A）。为清洁针尖，将软管连....

讨论

在本视频中，我们演示了一种用于分析斑马鱼视网膜和脑发育的卵裂球移植方法。通过将供体卵裂球释放到宿主胚胎的相应位置，该方案也可用于分析其他组织和器官的发育。使用GFP分子进行标记比使用荧光染料偶联的葡聚糖（Dextran）标记具有更清晰的背景（Ho和Kane，1990）。这是因为死亡供体细胞中残留的葡聚糖染料比GFP存留时间更长，从而干扰成像（Catalano 等., 2007）。此外，表达GFP的供体细胞比含有葡聚糖染料的细胞更健康。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 ¾" 玻璃移液管	Fisher Scientific	13-678-30
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
FluoroDish	World Precision Instruments, Inc.	FD35
垂直式拉针仪 / 移液管拉制仪	David Kopf Instruments	Model 720
微型研磨机	马利支	EG-400
微操作仪	Marishige	MF-830
手动显微注射泵	World Precision Instruments, Inc.	MMP
镊子	精细科学工具	11232-20
氢氟酸	Fisher Scientific	A147-1
青霉素-链霉素	GIBCO，Life Technologies 公司	15140-122
琼脂糖	Research Products International Corp.	9012-36-6
低熔点琼脂糖	Fisher Scientific	BP165-25
E3 卵水： <李>5 mM NaCl <李>0.17 mM KCl <李>0.33 mM CaCl2 <李>0.33 mM MgSO₄4 <李>0.1% 亚甲蓝
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