移植表达GFP的卵裂球用于嵌合斑马鱼胚胎视网膜和脑发育的活体成像

摘要

我们演示了一种用于生成嵌合体斑马鱼胚胎的实验方案，以在胚胎发育过程中对细胞行为进行活体成像观察。

摘要

在胚胎发生过程中，细胞的位置和特性会发生广泛变化，这些变化受到细胞与其环境之间相互作用的调控。由不同遗传背景细胞组成的嵌合胚胎是研究目的基因介导的细胞间相互作用的有力工具。斑马鱼在早期发育阶段具有胚胎透明性，可在细胞水平上直接观察组织和器官的形态发生过程。本文介绍了一种在斑马鱼胚胎中生成嵌合视网膜和脑组织并进行供体细胞活体成像的实验方案。该方案包括移植针的制备、将表达GFP的供体卵裂球移植到不表达GFP的宿主胚胎中，以及利用活细胞共聚焦显微镜观察供体细胞的行为。通过适当调整，该方案也可用于研究斑马鱼其他组织和器官的胚胎发育过程。文中还讨论了使用GFP标记供体细胞的优势。 嵌合胚胎，斑马鱼，细胞移植，活体成像，共聚焦显微镜，GFP，视网膜，脑发育，胚胎发生，细胞间相互作用

方案

第1天。准备

1. 建立鱼类交配组合

在傍晚设置斑马鱼的成对交配。为防止在预期时间前发生随机交配，使用隔离板将交配盒中的雌鱼和雄鱼分隔开。表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因鱼用作供体卵裂球的来源。本实验所用的pt104转基因品系（Zou et al., 2008）在EF1启动子的调控下组成型表达GFP。GFP的表达使得通过活体成像可直观观察供体细胞。根据特定需求，也可使用其他表达合适荧光蛋白的转基因鱼品系。

2. 准备楔形琼脂糖加样孔以固定胚胎

将用E3胚胎水（Westerfield, 2007）配制的1%熔融琼脂糖倒入培养皿中。将带有楔形突起的塑料模具漂浮于琼脂糖溶液上，静置直至琼脂糖溶液完全凝固。小心移除模具，并用E3水浸没琼脂糖凝胶床。

3. 准备受精针

使用垂直式拉针仪（David KOPF Instruments），将功率设置为11.5，通过拉制玻璃毛细管移液器（World Precision Instrument）制备微针。理想的针尖应具有细长的锥形结构。使用显微研磨仪（Marishige）以45度角研磨针尖，直至获得内径为40–45 μm的斜面开口（图1A）。为清洁针尖，将软管连接至微针的钝端，再将软管连接至注射器，反复吸取并释放10%氢氟酸溶液，直至去除所有可见碎屑。随后用蒸馏水冲洗针尖，再用100%乙醇冲洗。将微针置于空气中干燥，直至乙醇完全蒸发。确保针尖完全干燥至关重要：残留的乙醇会在高温抛光步骤中损坏微针。为软化并抛光针尖的粗糙边缘，使用显微塑形仪（Marishige）的灯丝产生的热量对针尖进行烘烤。抛光过程中切勿使针尖接触灯丝。可通过调节通过灯丝的电流强度以及灯丝与针尖之间的距离来控制加热条件。温度不宜过高，否则会导致针尖熔化变形。待粗糙边缘变得光滑后，小心地将针尖轻触加热的灯丝，然后缓慢将灯丝从针尖处拉开，从而形成尖锐末端（图1B）。锋利、光滑且洁净的微针对于获取完整的供体卵裂球以及避免损伤宿主胚胎至关重要。

4. 准备胚胎定位探针

在燃气火焰上拉制玻璃移液管，以获得末端光滑的细玻璃探针。该探针将用于在移植前将胚胎置于正确的方向。

第2天。胚细胞移植

1. 收集并去除胚胎的卵膜

第二天，移除十字配种盒中的隔板，使鱼类能够交配。将胚胎置于盛有E3水的培养皿中。然后用精细镊子手动撕除胚胎的绒毛膜，完成去膜操作。使用弯头玻璃移液管小心地将去膜后的胚胎转移至琼脂糖孔中。注意避免胚胎接触空气，以防胚胎破裂。将胚胎在琼脂糖孔中于28.5 °C条件下培养至受精后3小时（hpf）。

2. 建立移植装置

在胚胎发育的同时，通过将移植针连接至装有矿物油的微型泵送系统，搭建移植装置。确保系统无泄漏，且系统内无气泡残留。用矿物油回填整个移植针，仅留针尖开口处 0.5 - 1 μl 的空间不填充。

3. 卵裂球移植

移植卵裂球时，使用玻璃定位探针将3-4小时受精龄（hpf）胚胎的卵裂球一侧朝上定位。然后，将移植针轻轻插入供体胚胎，并缓慢吸取5-20个卵裂球进入针内。将含有卵裂球的针插入受体胚胎，并缓慢释放卵裂球。卵裂球释放的位置将影响其后代细胞在后续发育阶段的分布位置。为分析视网膜和脑部发育，应在动物极位置释放细胞。移植过程中，确保针尖不接触空气。为尽量减少机械损伤，将受体胚胎留在28.5 °C的琼脂糖孔中直至次日。随后，将嵌合胚胎转移至预先加入0.5 ml 1%琼脂糖的24孔板中，每孔放置一个胚胎，每孔加入1 ml E3胚胎培养液。为防止细菌感染，向E3胚胎培养液中加入10 μl 100X青霉素和链霉素。

第3天。嵌合胚胎的包埋与活体成像

1. 包埋胚胎

在E3胚胎水（egg water）中配制1.5%低熔点琼脂糖（LMP），并将溶液置于30 °C水浴中保温。将嵌合胚胎转移至底部为0.17 mm厚玻璃的FluoroDish组织培养皿（World Precision Instruments）中。去除多余的E3水，仅保留足以覆盖胚胎的少量E3水。向胚胎中加入30–50 μl融化的1.5% LMP琼脂糖溶液。在琼脂糖凝固前，迅速将眼睛或脑部调整至尽可能靠近玻璃底部的位置。待溶液冷却凝固后，再添加额外的琼脂糖溶液以进一步固定胚胎。随后，向凝固的琼脂糖块中加入2–3 ml E3胚胎水浸没。

2. 共聚焦成像

对于共聚焦显微镜观察，使用具有较大焦深的水浸式倒置物镜（Olympus，PlanApo，40 X/0.90 WLSM，日本）。在物镜上滴加一滴水，然后将 FluoroDish 细胞培养皿置于物镜上。为观察发育过程，通过每5分钟拍摄一次胚胎图像来进行延时成像。根据实验的具体需求，应调整拍摄之间的时间间隔。

代表性结果

图2展示了一例典型的24小时受精龄嵌合斑马鱼。GFP表达使供体细胞呈现绿色。视网膜神经上皮细胞贯穿视网膜壁的全层厚度。

该视频展示了在24 hpf时供体细胞在宿主大脑中的运动情况。请注意，细胞形态随时间发生变化。

图1. 移植针针尖的形状。A. 针尖斜面开口经氢氟酸清洗后无残留物。B. 针尖处形成尖锐末端。

图 2.在嵌合型斑马鱼胚胎中于24 hpf时观察表达GFP的供体细胞。左侧面板显示脑和视网膜中的GFP信号。中间面板为胚胎的明场图像。右侧面板显示合并图像。

视频 1. 对GFP阳性供体细胞的活体成像展示了发育过程中脑神经上皮细胞形态的显著变化。该视频的每一帧图像采集于24至25小时pf期间，每隔5分钟采集一次。点击此处观看视频。

讨论

在本视频中，我们演示了一种用于分析斑马鱼视网膜和脑发育的卵裂球移植方法。通过将供体卵裂球释放到宿主胚胎的相应位置，该方案也可用于分析其他组织和器官的发育。使用GFP分子进行标记比使用荧光染料偶联的葡聚糖（Dextran）标记具有更清晰的背景（Ho和Kane，1990）。这是因为死亡供体细胞中残留的葡聚糖染料比GFP存留时间更长，从而干扰成像（Catalano 等., 2007）。此外，表达GFP的供体细胞比含有葡聚糖染料的细胞更健康。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 ¾" 玻璃移液管	Fisher Scientific	13-678-30
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
FluoroDish	World Precision Instruments, Inc.	FD35
垂直式拉针仪 / 移液管拉制仪	David Kopf Instruments	Model 720
微型研磨机	马利支	EG-400
微操作仪	Marishige	MF-830
手动显微注射泵	World Precision Instruments, Inc.	MMP
镊子	精细科学工具	11232-20
氢氟酸	Fisher Scientific	A147-1
青霉素-链霉素	GIBCO，Life Technologies 公司	15140-122
琼脂糖	Research Products International Corp.	9012-36-6
低熔点琼脂糖	Fisher Scientific	BP165-25
E3 卵水： <李>5 mM NaCl <李>0.17 mM KCl <李>0.33 mM CaCl2 <李>0.33 mM MgSO₄4 <李>0.1% 亚甲蓝
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