人类胚胎干细胞集落生长的视频生物信息学分析

摘要

视频生物信息学是对从显微视频中提取的生物时空数据进行自动化处理、分析、理解及数据挖掘的技术。本文旨在展示一种利用视频生物信息学方法测量人类胚胎干细胞集落生长的方法。

摘要

由于视频数据结构复杂，包含大量图像，若无计算机软件辅助，从视频资料中提取信息极为困难。视频生物信息学是一种强大的定量方法，利用计算机软件对视频图像进行数据挖掘与分析，以提取时空数据。本文介绍一种视频生物信息学方法，通过分析在配备摄像装置的尼康BioStation CT培养箱中采集的延时视频，量化人类胚胎干细胞（hESC）的生长情况。在实验中，贴附于Matrigel基质上的人类胚胎干细胞集落被连续拍摄48小时。为确定这些集落的生长速率，我们使用CL-Quant软件开发了分析流程，该软件可帮助用户从视频图像中提取多种类型的数据。为准确评估集落生长情况，共设计了三个分析流程：第一个流程将图像分割为集落区域与背景区域；第二个流程增强图像质量，以精确定义整个视频序列中的集落轮廓；第三个流程则用于测量集落随时间变化的像素数量。上述三个流程依次应用于BioStation CT采集的视频数据，以分析单个hESC集落在48小时内的生长速率。为验证CL-Quant分析流程的准确性，我们使用Adobe Photoshop软件对相同数据进行人工分析。将CL-Quant流程与Photoshop分析所得结果进行比较，二者几乎完全一致，表明CL-Quant流程具有高度准确性。本文所述方法可广泛应用于各类视频数据，用于测量hESC或其他以集落形式生长的细胞的生长速率。此外，未来还可开发其他视频生物信息学分析流程，用于研究细胞迁移、细胞凋亡和细胞黏附等其他细胞过程。

方案

第一部分：实验步骤

视频数据包含大量信息，但这些信息通常难以提取，若由人工手动完成，可能需要耗费大量人力时间。人工手动分析还容易因解读差异而引入误差。视频生物信息学是指利用计算机软件从视频图像中挖掘特定数据的方法。这种分析方法速度快，且能够消除人工手动分析时可能出现的误差。本文旨在演示一种利用视频生物信息学方法对人类胚胎干细胞集落生长进行定量分析的技术。

本文中，使用尼康BioStation CT培养箱系统采集延时视频图像，该系统可对多个细胞区域随时间推移进行成像（图1）。本报告所述方法适用于通过任何视频显微镜装置采集的视频数据。

在我们的实验设计中，我们将 H9 人胚胎干细胞（hESC）接种于 12 孔组织培养板中，培养 48 小时。在此期间，细胞集落充分贴附并铺展在 Matrigel 上。随后，将带有贴壁 hESC 集落的培养板转移至 BioStation CT 中，继续孵育 48 小时。在 BioStation CT 运行期间，每隔 7 分钟采集一次集落的图像，并用于后续生成延时视频序列。随后，利用 CL-Quant 软件开发的视频生物信息学分析流程，对每个集落的视频进行分析，以量化集落的生长情况。使用 CL-Quant 软件创建的分析流程所得结果，通过 Adobe Photoshop 进行人工核查，以验证其准确性。

第2部分：附着的人胚胎干细胞集落的制备

1. 将hESC培养于Matrigel包被的6孔板中，当细胞融合度达到70%时，将其中一孔的细胞按以下步骤接种至5个Matrigel包被的12孔板孔中。
2. 吸除含有hESC的孔中的培养基。
3. 用1 ml PBS冲洗孔内2次。
4. 加入1 ml Accutase，于37°C、5% CO₂条件下孵育1分钟。
5. 向孔中加入10–12颗玻璃珠，轻轻摇动培养板，直至集落完全从孔底脱离。
6. 加入1 ml mTeSR培养基或mEF条件培养基以中和Accutase。
7. 将细胞悬液转移至15 ml锥形管中，在200g下离心3分钟。
8. 弃去上清液，并用500μl新鲜mTeSR培养基重悬细胞沉淀。
9. 将100μl hESC悬液逐滴加入12孔板的每个孔中。
10. 轻轻前后晃动培养板，并在光学显微镜下观察培养物，确保细胞团块在孔内均匀分布。
11. 将12孔板放回培养箱中。
12. 让hESC贴壁并生长48小时（也可使用更短时间）。
13. 48小时后，吸除培养基，并用500μl PBS洗涤各孔，以去除未贴壁的细胞。
14. 向每个孔中加入1 ml mTeSR培养基。
15. 注释：立即将培养板放入培养箱/显微镜中进行活细胞成像。
16. 开始采集延时图像。应尽量选择具有独立单个集落的视野，避免集落之间相互融合生长。
17. 可采用其他方法进行hESC的培养和接种，以替代上述实验方案。

第3部分：视频生物信息学

CL-Quant 软件被用于创建三个“方案”，依次运行这些方案可随时间确定每个菌落的像素数量或微米面积。这三个方案按顺序构建，在本应用中包括分割、增强和测量。

使用 CL-Quant 软件/方案开发分析 hESC 克隆生长：

1. 首先创建分割方案。
2. 扫描整个视频，确保视频可用。检查确认整个菌落始终位于视野内，且其他菌落未进入视野。
3. 打开分割向导，点击“下一步”按钮。
4. 选择正确的图像通道（例如相位、绿色、红色等），然后点击“下一步”按钮。
5. 在三个选项中选择“软匹配”，然后点击“下一步”。
6. 通过在图像上圈选区域来选择“需要”区域，通常从菌落外缘至菌落中心区域。
   • 该区域应尽可能小，但需能代表整个菌落。
   • 使用相差显微镜时，务必包含菌落周围的光晕，以确保软件精确选择菌落。
   • 选择1至2个可能在菌落内显示不同像素模式的兴趣区域，但不要选择过多“需要”区域，以免导致掩膜应用不准确。
7. 点击“下一步”按钮。
8. 通过在图像上圈选不属于菌落也不属于背景的区域，选择“不需要”区域。这些是希望抑制的区域，包括碎片、死细胞等伪影像素。点击“下一步”。
9. 通过圈选希望抑制的区域来选择“背景”。
   • “不需要”区域与“背景”区域的区别在于，背景应是均匀的，并且可能在每一帧中都出现。
   • 通常我们选择菌落周围的灰色背景区域。
10. 点击“下一步”按钮。
11. 应在兴趣区域上显示彩色掩膜（图2A）。
12. 如果掩膜未能准确覆盖兴趣区域，可增加或减少分割阈值范围（位于软件界面右下角）。
13. 如有必要，分割向导将提示进一步微调掩膜区域。
14. 如果希望修改掩膜，选择“更新软匹配区域”，即可更改“需要”、“不需要”或“背景”区域。
15. 如果掩膜满意，选择“应用阈值并保存掩膜”，然后点击“下一步”按钮。
16. 掩膜将以不同颜色显示。
17. 选择“完成”。
18. 方案应显示在软件界面右上角，并命名为“分割方案”。
19. 如需重命名方案，可通过右键点击并选择“重命名”进行操作。
20. 为进行抽样检查，右键点击并将鼠标悬停在“应用方案”上。
21. 将弹出菜单，允许您选择抽样检查方案时使用的帧数。建议每隔10帧运行一次方案，以抽样检查掩膜定位的准确性。
22. 如果掩膜捕获了不希望的小区域或碎片部分，可创建“增强方案”以改善掩膜与兴趣区域的贴合度。
23. 要创建增强方案，右键点击“增强方案”文件夹，然后点击“新建”，应显示一个新的增强方案。
24. 在原始视野（FOV）中，点击图像右侧的“切换增强模块”按钮。将鼠标悬停在工具栏图标上以识别正确按钮。
25. 选择“标记”下拉菜单。
26. 选择“标记4连通”。
27. 选择“标记4连通2”。
28. 应显示一个新的任务栏。
29. 从分割方案中获取初始掩膜（mask0），并将其拖动到“输入”框中。
30. 任务栏现在应显示“输入掩膜#”。
31. 将带有“输入掩膜#”的图标拖动到mask 0图标上。
32. 在任务栏中找到“最小尺寸”并调整数值，直到仅显示兴趣区域。每次拟合试验时务必点击“执行”。
33. 当您对最小尺寸调整满意后，点击之前创建的“增强方案”（图2B）。
34. 在屏幕底部，选择“保存至方案”。
35. 软件将提示“是否覆盖所选方案？”，选择“是”。
36. 使用与上述分割抽样检查相同的流程，对增强方案进行抽样检查。
37. 如果对分割方案和增强方案均满意，在右侧工具栏中选择“创建测量模板”。
38. 如需，可重命名该模板。
39. 在测量模板窗口中，将光标移至剪贴画细胞图形上，按住Ctrl键并选择该细胞。
40. 取消勾选“默认参数”，在“形态学”下勾选“面积参数”。
41. 退出“模板”窗口。
42. 选择在测量方案中创建的图标。
43. 重命名该方案。
44. 移动并选择右上角的“模板”选项卡。
45. 将之前创建的测量模板拖放到测量窗口中。
46. 点击“是”继续。
47. 在测量方案窗口中，选择“通道映射”，然后选择“全细胞”。
48. 选择“掩膜映射”。
49. 然后为增强掩膜选择“全细胞”选项。
50. 在主窗口的“方案”选项卡下选择“测量方案”。
51. 在测量方案窗口中选择“保存”图标。
52. 然后关闭该窗口。
53. 现在，关闭并重新打开“FOV”。
54. 右键点击“方案”图标，选择“锁定方案列表”，然后按顺序在视频数据上运行各方案。

第4部分：使用Photoshop软件检查配方准确性

为了验证使用（CL-Quant 软件）创建的实验方案，可使用 Adobe Photoshop 对相同数据进行手动分析。在此分析中，每隔 10 帧（即每隔 70 分钟的时间点）进行分析，以测量 48 小时内的菌落大小。

1. 在 Adobe Photoshop 中打开一张菌落图像的帧。
2. 单击工具栏中的“魔棒工具”。
3. 单击菌落周围的区域，使整个视野被选中，仅排除菌落区域。
4. 单击工具栏中的“以快速蒙版模式编辑”，然后单击菌落区域，使菌落被选中。
5. 确保菌落周围的虚线准确贴合菌落的边缘，而不是位于菌落内部。如果虚线未贴合边缘，请相应调整上方工具栏中的容差值。
6. 进入“窗口”下拉菜单，单击“直方图”。
7. 记录缓存（cache）=1 时的像素值。如果缓存为 2，请单击“!”将其更改为缓存 1，然后记录像素值。
8. 对每第 10 帧重复上述过程。如需要，也可使用更少的总帧数。
9. 使用 Photoshop 和 CL-Quant 软件收集的数据可合并绘图。如果 CL-Quant 的分析流程准确可靠，则 Photoshop 与 CL-Quant 的分析曲线应非常相似（图 3-5）。
10. 如果使用 CL-Quant 开发的分析流程准确可靠，则可将其可靠地应用于其他视频数据。
11. 在本分析中应用视频生物信息学的优势在于，一旦分割、增强和测量的分析流程被开发并验证，其执行分析的速度将远快于人工使用 Photoshop，并且准确性更高。

代表性结果

图1： 在BioStation CT中培养48小时期间，不同时间点拍摄的人胚胎干细胞（hESC）克隆的影像条带。图像每7分钟采集一次。

图2：(A) 人类胚胎干细胞（hESC）图像，分割方案已在集落上施加了掩膜。碎片和背景区域也被掩膜标记，表明需要增强方案以提高评估的准确性。(B) 与“A”中相同的集落经增强处理后的图像。此时掩膜仅选择集落区域，且选择中的噪声已被消除。

图 3: 通过 CL-Quant 软件和 Photoshop 测定得到的菌落大小（以像素计）在 48 小时内的增长曲线。该图展示了原始数据，显示菌落起始大小存在差异，同时也表明两种测量方法的结果具有良好的一致性。

图 4：将图 3 中相同数据进行归一化处理后绘制的图表，以显示 48 小时内菌落尺寸的百分比增长。结果表明，无论初始菌落大小如何，其生长速率均相似，且两种分析方法得出的结果相近。

图 5：显示图 4 中归一化数据均值的图表。该图清楚地表明，使用视频生物信息学（CL-Quant 软件）与 Photoshop 进行的分析结果具有良好的一致性，证明了该实验方案的可靠性。Photoshop 数据在第 325 帧时面积略有下降，是由于部分视频未被纳入 Photoshop 分析所致。

讨论

视频生物信息学工具能够快速从视频图像中提取数据，功能强大。我们用于定量分析人胚胎干细胞（hESC）集落生长的实验方案，展示了视频生物信息学在生物学问题中的一个应用实例。该方法具有定量性，并且能够提供来自单个人胚胎干细胞集落的详细数据，具有独特优势。通过开发视频生物信息学分析流程，还可用于监测其他细胞过程，例如细胞增殖、迁移、凋亡、细胞与基质的黏附以及细胞与相邻细胞之间的黏附。使用CL-Quant软件开发的分析流程已通过Photoshop进行验证，结果证实其准确性可靠。一旦建立了合适的分析流程，即可快速分析来自任何来源的视频数据。与使用Photoshop手动分析相比，采用视频生物信息学工具分析视频数据所需时间显著缩短。此外，计算机分析的误差更小，因为计算机每次都会以完全相同的方式处理数据，而人工分析则可能在每次图像分析时产生误差或做出略有不同的判断。尽管本实验方案未详细讨论，但视频还可用于观察集落形态的变化，这一参数在包含处理组的实验中尤为有用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
mTeSR1 人胚胎干细胞维持培养基	Stem Cell Technologies	05850	或任何适用于 hESC 培养的培养基。
BD Matrigel	BD Biosciences	356234	或其他合适的基质。
DMEM/F12 基础培养基	Invitrogen	11330-032
不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲液
Accutase 酶解细胞消化液	eBioscience	00-4555-56	或其他合适的细胞解离酶。
3 mm 玻璃珠	Fisher Scientific	11-312A	可选。
12 孔组织培养板	BD Biosciences	353043	或其他任意规格的培养板。
Nikon BioStation CT/IM			或其他适用于采集视频数据的培养箱/显微镜系统。
CL-Quant 软件（Nikon）和/或 Photoshop（Adobe）。