视频人类胚胎干细胞克隆生长的生物信息学分析

第1部分:实验步骤

视频数据包含了丰富的信息。然而，这些信息往往是难以提取和手工完成人类和人员时间可能需要许多小时才能完成。人类的人工分析也受到解释和错误的变异。视频生物信息学涉及计算机软件的使用矿从视频图像中的特定数据。这种分析方法是快速，并能消除发生的错误的分析是通过人类手动。本文的目的是表现出人类胚胎干细胞菌落生长，使用视频生物信息学方法进行量化的方法。

在本文中，时间的推移视频图像采集使用尼康BioStation CT孵化单元，允许随着时间的推移成像等多个领域的细胞（图1）。在这份报告中所描述的方法适用于任何视频显微成立收集到的视频数据。

在我们的实验设计中，我们在48小时12孔组织培养板镀H9的人类胚胎干细胞。在此期间，菌落让其充分重视和蔓延对基质胶。然后，附加的人类胚胎干细胞殖民地的板块转移到BioStation的CT和一个额外的48小时内孵化。虽然在BioStation，殖民地的图像采集在7分钟的时间间隔，后来被用于创建延时视频序列。每个殖民地的影片，然后进行分析，以量化菌落生长，使用视频生物信息学与CL - QUANT软件开发的食谱。分析使用与CL - QUANT软件检查的真实性，手动使用Adobe Photoshop中创建的菜谱。

第2部分:附加的人类胚胎干细胞殖民地的制备

1. 生长在基质胶人类胚胎干细胞涂6孔板，一旦达到70％汇合，replate如下分为5个井12井基质胶涂层板6孔板。
2. 吸从以及含有人类胚胎干细胞的培养基。
3. 冲洗干净2倍，而与PBS1毫升。
4. 添加Accutase和孵化1分钟1毫升，在37 ° C和5％的_CO 2 。
5. 添加入井10-12玻璃珠，轻轻地摇板的殖民地，直到完全脱离井底。
6. 抵消Accutase使用1毫升mTeSR中等或MEF条件培养基。
7. 在200克离心3分钟15毫升锥形管的细胞悬液。
8. 倒出新鲜mTeSR培养基500μL上清，打破颗粒。
9. 板块下跌明智的人类胚胎干细胞悬浮液在12孔板，每孔100μL。
10. 岩石板来回轻轻地，光镜下观察文化。确保细胞团块均匀分布在整个板块。
11. 将进入孵化器的12孔板回。
12. 允许人类胚胎干细胞附着和增长为48小时（可以使用更短的时间内）。
13. 48小时后，倒出中期和500ul的PBS洗井，以消除独立的细胞。
14. mTeSR中等1ml到每口井。
15. 评论:立即放入孵化器/视频成像显微镜板。
16. 开始收集时间推移图像。尽量选择与分立，是不可能成长为其他殖民地的单菌落领域。
17. 培养和建立人类胚胎干细胞的其他方法可以用来代替上述协议。

第3部分:生物信息学视频

CL - QUANT软件是用来创建三个"食谱"，按顺序运行时，将决定每个随着时间的推移殖民地微米的像素数或面积。在此应用程序的顺序和内置的三个食谱包括分割，增强和测量。

分析人类胚胎干细胞菌落生长，使用CL - QUANT软件/配方开发:

1. 首先创建分割配方 。
2. 扫描整个视频，确保视频可用。检查，以确保整个殖民地在视野和其他殖民地不进入这个领域仍然。
3. 打开分割向导，然后单击"下一步"按钮。
4. 选择正确的图像通道（即阶段，绿色，红色等），并单击"下一步"按钮。
5. 挑选出3个选择的"软匹配"，并点击"下一步"。
6. 盘旋在图像上通常的外缘中部地区的殖民地的殖民地地区，选择"希望"地区。
   • 此区域应尽可能小，但应该是代表整个殖民地。
   • 使用相衬显微镜时，一定要包括的光环围绕软件精确的殖民地选择殖民地。
   • 选1或2个地区的利益，可能会呈现出不同的的像素模式内的殖民地，但不要挑太多"希望"，这可能会导致不准确的面膜中的应用。
7. 点击"下一步"按钮。
8. 选择"不想"盘旋在图像上的区域不属于殖民地的一部分，而不是背景的一部分地区。这些模式，你想等文物碎片和死细胞，抑制和包括像素的地区。点击"下一步"。
9. 盘旋你想压制的地区，选择"背景"。
   • "不想要"和"背景"地区在这样的背景下不同，应该是统一的和可能出现在每帧。
   • 通常情况下，我们选择的灰色背景，周围的殖民地。
10. 点击"下一步"按钮。
11. 彩色面具应显示在你感兴趣的区域（图2A）。
12. 如果掩码不准确覆盖地区的利益，分割阈值范围内（位于右下角的软件显示的右上角）可能会增加或减少。
13. 如果有必要进一步屏蔽区域微调分割向导提示。
14. 如果你想改变你的面具，选择"更新软匹配的地区"。这允许你改变"要"，"不想"，或"背景"的范畴。
15. 如果掩码是令人满意的，选择"申请门槛，并保存我的面具"，并点击"下一步"按钮。
16. 面具便会显示出不同的颜色。
17. 选择"完成"。
18. 配方应显示在右边的软件右上角，它应该被称为"分割配方"。
19. 重命名的配方，如果你希望通过右键单击"重命名"。
20. 对于抽查中，右键单击和鼠标放在"申请配方"。
21. 将显示一个菜单，允许你选择你想的帧的数量，使用时，抽查的配方。抽查面具安置的准确性每10帧运行配方。
22. 如果掩码拿起小不需要的地区或碎片的部分，你可以创建一个"增强配方"的面具，以改善装修感兴趣的区域。
23. 要创建一个增强配方 ，右击"增强配方"文件夹，然后单击"新建"。应显示一个新的增强配方。
24. 从原始字段的视角（FOV），点击"切换增强模块"按钮，在图​​像的右侧。鼠标悬停在工具栏上的图标，以确定​​正确的。
25. 选择"标签"下拉菜单。
26. 选择"标签4连接"。
27. 选择"标签4 connected2"。
28. 一个新的任务栏应该显示。
29. 抓斗从最初的面具（mask0）分割配方，将其拖动到"输入"框。
30. 酒吧现在应该显示"输入掩码＃"。
31. 拖动图标"输入掩码＃"面具0图标。
32. 在任务栏上的"最小尺寸"查找和调整的数量，直到显示唯一感兴趣的地区。请务必点击"执行"，通过每个接头试验。
33. 一旦你与你的最小尺寸调整满意后，单击你以前创建的"增强配方"。 （图2B）
34. 在屏幕的底部，选择"保存到配方"。
35. 该软件现在提示"覆盖所选的配方吗？"，选择"是"
36. 抽查抽查分割使用上述同样的程序增强配方。
37. 如果满意的分割和增强配方，选择右手工具栏上的"创建测量模板"。
38. 如果你想重命名模板。
39. 在测量模板"窗口，对剪贴画细胞的身影的光标移动。按住Ctrl键并选中该单元格。
40. 取消选中"默认参数"和检查"区域参数"下的"形态"。
41. 退出"模板"窗口。
42. 选择测量配方中创建的图标。
43. 重命名的配方。
44. 移动到"模板"标签，并在右上角选择。
45. 拖放到测量窗口您以前创建的测量模板。
46. 点击"是"继续。
47. 在测量配方窗口中，选择"频道映射"，然后"全细胞"。
48. 选择"面具映射"。
49. 然后选择"全细胞"选项增强的面具。
50. 选择测量下在主窗口中的配方"选项卡的"良方"。
51. 测量配方窗口内选择"保存"图标。
52. 然后关闭窗口。
53. 现在，关闭并重新打开"视野"。
54. 右键单击"配方"图标，选择"锁定配方列表和顺序上运行您的视频数据的食谱。

第4部分:使用Photoshop软件检查配方的准确性

为了验证（CL - QUANT softw创建配方都是），相同的数据，可以手动分析与Adobe Photoshop。对于这种分析，每10帧（每70分钟的时间点）进行了分析，超过48小时的殖民地的大小来衡量。

1. 打开在Adobe Photoshop的殖民地图像帧。
2. 点击工具栏上的魔术棒工具。
3. 各地的殖民地面积，使整场除了殖民地地区覆盖。
4. 点击"编辑快速蒙版模式"在工具栏上，单击殖民地，所以选择殖民地。
5. 确保各地的殖民地的虚线适合对周围殖民地的边缘，而不是它里面。如果虚线环绕周边，改变上部的工具栏上相应的公差值。
6. 转到"窗口"下拉菜单，并点击"直方图"。
7. 写下的像素值缓存= 1时。如果缓存是2，点击"！"改变缓存1，然后注意的像素值。
8. 为每10帧重复上述过程。如果需要的话，可以用更少的总帧数。
9. 然后，可以使用Photoshop和CL - QUANT软件收集的数据绘制在一起。如果CL - QUANT的食谱是真实的，为Photoshop和CL - QUANT分析的曲线应该是非常相似（图3-5）。
10. 如果CL - QUANT开发的食谱是诚实的，他们可以可靠地应用到其他的视频数据。
11. 在这种分析中使用视频的生物信息学的价值是，一旦分割，增强和测量配方开发和验证，他们将执行的分析，更迅速，更准确地比人类使用Photoshop。

代表性的成果

图1:一个人类胚胎干细胞的殖民地，在BioStation CT的增长在48小时内显示在不同的时间帧的电影带。在7分钟的时间间隔帧。

图2:（一）形象与人类胚胎干细胞置于殖民地分割配方口罩。碎片和背景等方面也掩盖表明增强配方需要，以提高评价的准确性。 （二）已执行相同的殖民地的形象，增强后在"A"所示。面具现在选择只有殖民地和噪音已经被淘汰选择。

图3:图表显示增加聚落的大小（以像素为单位）超过48小时，使用CL - QUANT软件和Photoshop。此图的原始数据表明，菌落开始在大小不同的地块。它也表明，这两种方法的测量好的协议。

图4:图表显示正常化后，如图3相同的数据显示超过48小时的群体规模增加百分之。这表明，增长率不管开始殖民地的大小和分析这两项措施提供了类似的结果相似。

图5:图表显示在图4中的规范化数据的手段。该图清楚地显示之间使用生物信息学（CL - QUANT软件）和Photoshop视频，并建立配方是真实的分析的好协议。面积为325帧的Photoshop数据略有下滑是由于不被包含在Photoshop分析的几部影片。

Video bioinformatics tools are powerful for rapidly extracting data from video images. Our protocol for quantifying hESC colony growth demonstrates one application of video bioinformatics to a biological problem. This method is quantitative and has the interesting feature of revealing data from individual hESC colonies. Video bioinformatics recipes can be developed to monitor other cellular processes such as proliferation, migration, apoptosis, and cell attachment to the substrate, and cell attachment to adjacent cells. The accuracy of the recipes developed using CL-Quant software was validated using Photoshop and was found to be truthful. Once the appropriate recipes are developed, video data from any source can be analyzed very quickly. The time required to analyze video data using video bioinformatics tools is significantly less than the time needed for analysis performed by hand using Photoshop. Moreover, the analysis done by the computer is less prone to error, as the computer will analyze the data the same way each time, while a human performing an analysis may make errors or slightly different judgments each time an image is analyzed. Although not discussed as part of this protocol, videos can also be examined for morphological changes in the colony. This parameter would be useful in cases where treatment groups are included.