直接向小鼠肺部气管内灌注溶质

摘要

经气管灌注可将溶质直接递送至肺部。该操作旨在将灌注液输送至肺的远端区域，因此常被用于肺泡相关研究。我们提供了一套详细的小鼠经气管灌注存活实验操作方案。

摘要

气管内滴注可将溶质直接递送至肺部。该操作旨在将滴注液输送至肺的远端区域，因此常被用于肺泡相关研究。本文提供了一种在小鼠中进行气管内滴注的详细存活手术方案。利用该方法，可将待测溶质或固体物质（如肺部治疗药物、表面活性剂、病毒及小段寡核苷酸）靶向递送至肺远端。相较于主要作用于上呼吸道且可能使研究人员暴露于潜在有害物质的吸入法，气管滴注可能是更优的方法。此外，采用气管滴注方案，动物可在非侵入性操作后完全恢复，从而允许对同一实验动物进行后续生理学指标检测或重复给药。注入肺部的滴注液体积必须精确确定，并保持渗透压平衡，以确保动物顺利恢复。通常，可向小鼠肺部注入30–75 μL的滴注液。

方案

1. 麻醉

1. 使用异氟烷麻醉小鼠可能有助于在腹腔注射麻醉剂前对动物进行操作和固定。然而，吸入性麻醉剂可能并不适用于所有研究：在开展肺部相关研究前，应首先评估使用异氟烷或其他麻醉剂可能带来的影响。
2. 使用异氟烷对动物进行麻醉。视频中展示了将异氟烷挥发罐腔室设定为2%异氟烷与氧气混合的使用方法。若无异氟烷专用腔室，也可采用标准的开放式滴加暴露技术。将大鼠置于钟形罩（或其他合适的无孔容器）内，底部装有金属网。在金属网下方放置一块纱布垫，并滴加体积分数为30%的异氟烷丙二醇溶液。使用金属网可确保动物不会直接接触浸有异氟烷的纱布垫，从而避免皮肤刺激和潜在的过量麻醉。短时间暴露后，动物应已进入麻醉状态，当倾斜钟形罩时不再出现翻正反射，且脚趾受到夹捏刺激后无反应。
3. 通过腹腔注射赛拉嗪与氯胺酮混合液对小鼠进行进一步镇静。（进行腹腔注射时，回抽确认针头未刺入肠道或其他重要器官是良好的操作规范。）将150 μL赛拉嗪（100 mg/mL）与1000 μL氯胺酮（100 mg/mL）溶于8850 μL的0.9%无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。对小鼠的给药剂量约为每10克体重80 μL。最终剂量为赛拉嗪10 mg/kg和氯胺酮100 mg/kg。应保持动物干燥并做好保温，以防止体温过度散失。可涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。

2. 手术区域准备

1. 对将进行手术切口的区域进行剃毛，可防止未消毒区域的污染物进入。可使用电动剃刀将动物体表的毛发紧密剃除。剃毛范围应大于手术切口区域。
2. 随后使用脱毛膏（如Nair）可去除残留的所有毛发。在手术区域涂抹一层厚厚的脱毛膏，保留3分钟。用湿润的毛巾擦去毛发和脱毛膏。脱毛膏停留时间不得超过10分钟。
3. 使用70%酒精或其它替代性消毒液对手术区域进行无菌准备。

3. 手术步骤

1. 将麻醉后的动物置于倾斜的手术板或成角度的固定架上。
2. 在颈部前侧（喉部区域）做一个小切口。
3. 分离颈阔肌和气管前肌，以暴露并接触到气管环。
4. 通常，气管内注射剂量为每克体重3 μl（最终体积约为30–75 μL）。使用带有30号、5/16英寸针头的1 mL皮下注射器，注入适量的灌注液。持注射器时针尖斜面朝上，并与气管平行，将全部灌注液体注入气管内。
5. 灌注溶液进入肺部后，动物可能会出现喘息反应。通过注射器注入空气并观察肺部是否扩张，也可验证插管操作是否成功。
6. 从气管中取出注射器。

4. 缝合。

1. 使用持针器夹住针的针柄（即缝线材料所连接的针最粗部分）。
2. 根据皮肤厚度，将针尖以90°角刺入皮肤，进针点距离伤口边缘约1-3 mm。针穿过组织后，用持针器夹住穿出的针体。采用单个打结的单纯缝合线可有效关闭伤口。

5. 动物恢复

1. 动物应在 3-24 小时内完全从麻醉和手术过程中恢复。

6. 代表性结果

通过气管内灌注荧光化合物Cy5.5标记的葡聚糖，可观察到荧光化合物成功灌注至B6小鼠肺部（图1）。该荧光染料主要靶向肺组织，且分布均匀。操作后立即在胃肠道中观察到荧光信号，表明操作过程中意外地将导管插入了食管（图2）。研究者还可通过在操作后充气肺部并制备肺组织切片（2；3）或固定后的组织学样本，来验证化合物是否靶向递送至肺部，并检查灌注物的分布情况。

图1. 荧光染料Cy5.5信号与X射线图像在成功灌注的小鼠肺组织中共同注册。将1.4 mg Cy5.5标记的葡聚糖（浓度为10 μg/μL）经气管灌注至B6小鼠肺部。使用675 nm激发滤光片和695 nm发射滤光片检测Cy5.5信号。

图2. 荧光信号与X射线叠加图像在灌注不良小鼠中的共定位。在气管灌注过程中若误将导管插入食管，会导致Cy5.5进入肠道。

讨论

在多项研究中，气管内灌注已被用于评估受试化合物的毒性（6），诱导肺泡损伤（4；7），替代表面活性物质（8），以及通过将小寡核苷酸直接递送至肺部来改变基因表达（5）。目前，我们正在探索将1）荧光氧化还原敏感材料灌注至肺内，以在正常和病理生理条件下体内测量氧化应激；以及2）将荧光指示剂与药理学化合物、DNA载体、病毒和/或microRNA共同灌注，以评估每种灌注物对肺液体转运的影响。

与吸入暴露相比，使用滴注法将外源物质引入肺部具有多种优势（详见文献(1)综述）。采用滴注法的主要优点在于能够限制对有毒、致癌或放射性化合物的暴露。此外，固体和液体物质均可通过该方法导入肺部。可以认为，气管滴注法最大的缺点是滴注过程具有侵入性且不符合生理状态。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷	Webster Veterinary	14043-220-05
赛拉嗪	Lloyd, Inc.		New Animal Drug Application #139-236
氯胺酮	Bioniche Pharma	67457-001-10
Nair			可在药店购买
1 mL 皮下注射器	BD Biosciences	309597	26 5/8 G
4-0 尼龙缝线	Ethicon Inc.	1894G.S30