本文介绍了花序浸渍法 Agrobacterium tumefaciens 介导的转化 拟南芥通过引入细胞周期调控的启动子-报告基因系统， pTSO2::β-葡萄糖醛酸酶（GUS），进入 拟南芥我们展示了如何在转基因幼苗中检测GUS报告基因的表达。
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本文内容
摘要
摘要
将外源基因导入生物体的能力是现代生物学和生物技术的基础。在模式开花植物中Arabidopsis thaliana，花序浸润转化法1-2因其简便、高效且成本低廉，已取代所有先前的方法。具体而言，幼嫩开花植株的茎尖Arabidopsis植物被浸入一种溶液中Agrobacterium tumefaciens携带特定质粒构建体。浸染后，将植株放回正常生长条件并收获种子，其中极小部分种子因转入了外源基因，可在含抗生素的培养基上被筛选出来。该花序浸染法极大地促进了Arabidopsis研究极大地促进了我们对植物基因功能的理解。在本研究中，我们采用花序浸润法（floral-dip method）转化一个报告基因，β-葡萄糖醛酸苷酶 (GUS)，在控制下TSO2启动子TSO2，编码核糖核苷酸还原酶（RNR）小亚基3, 是一种在细胞周期中受调控的基因，对细胞周期S期的脱氧核苷二磷酸（dNDP）生物合成至关重要。对该基因的检测GUS转基因中的表达Arabidopsis幼苗显示TSO2在活跃分裂的组织中表达。所报道的实验方法和材料不仅易于应用于科研，也可轻松适用于高中和大学阶段的教育。
方案
I. 花浸法转化 拟南芥
- 转化前约1个月，播种 拟南芥 将种子播种到4至8个花盆（5英寸方形盆）中，每盆约10-15株植物。对于育性正常的植物，每种质粒构建体种植4盆即可。若需转化突变体 拟南芥 生育力降低时，应相应增加花盆数量。
- 植物在标准条件下培养（16小时光照，8小时黑暗） 22°C）。如果植物在较短日照或较低温度条件下生长，开花时间会延长，达到适合转化的状态所需时间也会更长。良好的植株管理可确保植株健康，而健康的植株是成功转化的关键。
- 当植株刚刚抽薹并开始开花时，即可进行转化。为了提高转化效率，在转化前3-4天，一旦主花序抽薹，立即剪除，以促进更多侧枝的形成。转化前一天给植株浇水，以确保土壤在花序浸润过程中不会吸收过多的侵染液。
- 转化前两天，在含有适当抗生素的40 ml LB培养基中接种（若使用 pTSO2::GUS, 50 μg/ml 卡那霉素）与 农杆菌 根癌农杆菌 携带GV3101菌株的 pTSO2::GUS 构建。该 pTSO2::GUS 克隆于 pBIN20 具有以下特性的载体 NPTII 赋予卡那霉素抗性的基因3. 在28-30°C.
- 次日，将8ml过夜培养物转移至含LB培养基的400ml中 50 μg/ml 卡那霉素。在28-30°C.
- 转化当天，当OD600 的 农杆菌 培养物浓度达到约 0.8（OD600 介于0.5至1之间为可接受范围），离心沉淀 农杆菌 5000 rpm 离心 8 分钟。
- 重悬 农杆菌 在1 L（升）侵染培养基（10 mM MgCl₂）中重悬菌体沉淀2，5% 蔗糖，0.44 mM 6-苄基腺嘌呤（BA），0.3% Silwet L-77，1× Gamborg's 维生素溶液和灭菌水）。该培养基无需高压灭菌，但需新鲜配制。将 1 L 农杆菌含渗透介质的培养皿（如 8"x15"x2" Pyrex 玻璃皿）
- 将花盆倒置（植株不会脱落），依次将每盆植物的地上部分浸入浸润溶液中，保持5分钟。在植物地上部分完全浸入浸润液期间，避免土壤吸收任何浸润液，以减少土壤表面真菌生长的可能性。
- 浸润后，将所有浸润过的盆钵侧放在托盘中多层纸巾上。纸巾可吸收多余的浸润培养基。用塑料膜覆盖托盘以保持高湿度。将托盘放入植物生长室中。
- 次日，取下塑料膜和纸巾，将花盆直立放置。此后四至五天内不要浇水。之后正常养护植株，直至结籽，并批量收集种子。
- 将含有MS培养基的培养皿（150×15 mm培养皿）倒入 50 μg/ml 卡那霉素（称取2.2 g不含维生素的MS基础盐，溶于500 ml水中，用1 M NaOH调节pH至5.8，加入4 g琼脂，高压灭菌，冷却后加入卡那霉素） 50 μg/ml 终浓度）。将培养板置于 4°C 直至需要时
- 为筛选具有抗生素抗性的转基因植株，至少需要筛选20,000粒种子。0.1克约等于5,000粒种子。称重并估算种子数量。
- 将种子置于15 ml Falcon管中，用70%乙醇振荡处理30秒以灭菌。用无菌水洗涤种子一次。将种子浸入含市售5%次氯酸钠（Clorox）按1:10稀释的溶液中30秒。用无菌水冲洗种子三至六次。在超净工作台中，用移液器将约5000粒种子转移至每块MS（卡那霉素）培养基平板上，均匀铺开种子，用3M Micropore胶带密封平板以防止污染。
- 将培养板置于培养箱中孵育 4°C 在黑暗条件下培养 3-4 天，然后将培养板转移至培养室（可使用相同的植物生长培养室）。约 14 天后，转基因幼苗保持绿色，而非转基因幼苗则逐渐变黄并死亡。将转基因幼苗从培养基中缓慢拔出根部，移栽至土壤中。
II. 检测 pTSO2::GUS 表达模式
- 收获 pTSO2::GUS 转基因幼苗，并将其放入盛有预冷90%丙酮的玻璃闪烁瓶或微量离心管中，置于冰上。若需分析大量样品，也可使用聚苯乙烯微孔板（不可使用聚丙烯材质）。
- 待所有样品收获完毕后，将样品管于室温放置20分钟。在此期间，配制不含x-Gluc的新鲜染色缓冲液（0.2% Triton x-100，50 mM NaHPO4 缓冲液 pH 7.2，2 mM 亚铁氰化钾，2 mM 铁氰化钾），并置于冰上备用。
- 去除样品中的丙酮，加入染色缓冲液。
- 配制x-Gluc染色液（0.2% Triton x-100，50 mM NaHPO4 缓冲液 pH 7.2，2 mM 亚铁氰化钾，2 mM 铁氰化钾，2 mM x-Gluc）。去除样品中的染色缓冲液，加入含x-Gluc的染色液。
- 将样品置于真空条件下浸润15至20分钟。缓慢释放真空，确认所有样品沉入染色液液面以下。如有必要，重复浸润操作，直至释放真空后所有样品均下沉。
- 将样品在含x-Gluc的染色液中于37°C过夜孵育。
- 从孵育器中取出样品，去除染色液。依次用20%、35%和50%乙醇溶液在室温下洗涤，每次更换溶液后洗涤30分钟。
- 用FAA固定液（50%乙醇、5%甲醛、10%乙酸，其余为水）在室温下固定组织30分钟。去除FAA，加入70%乙醇。此时可在配备数码相机的解剖显微镜下观察并拍照记录组织。深蓝色区域表示 TSO2 的表达位置（图1）。或者，组织可在4°C下保存，以备后续观察。
图1. pTSO2::GUS 在转基因幼苗（A）、侧根（B）和根尖（C）中的表达。注意 TSO2 启动子在幼嫩且正在分裂的组织中具有高度活性。（C）中所示的散在表达模式是特定细胞周期阶段表达基因的典型特征。
代表性结果
操作正确时，转化效率应约为 0.1–0.2%。换句话说，每筛选 5000 粒种子应获得 5–10 株转基因幼苗。平均而言，通过转化 4 盆野生型植株可获得约 100 株转基因株系。
对于含有pTSO2::GUS构建体的转基因幼苗3，反映GUS活性的深蓝色出现在活跃分裂的细胞中，包括幼叶、茎尖、根尖和侧根原基（图1）。这种不均匀的散在分布模式是细胞周期时相特异性表达的特征。
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讨论
转化效率由多种不同因素决定，这些因素将在下文讨论：
- 植物的健康状况及其苗龄至关重要。理想材料为约一个月大、带有大量未成熟花蕾的植株。在转化前3-4天剪除主茎以促进侧枝生成，可提高转化效率。较老的植株虽也能获得转化子，但效率较低。
- 植物的育性非常重要。若需转化育性降低的突变体，则需要准备更多的植株用于浸染。
- 浸染缓冲液中添加0.3% Silwet L-77表面活性剂被认为是必需的。
- 植株在浸染液中的浸染时间应至少持续5分钟。
- 为减少真菌污染，需采取多项预防措施。首先，应在浸染前一天对植株或土壤浇水，避免土壤在浸染过程中吸收浸染液；切勿将土壤浸入浸染液中。其次，浸染后24小时内应移除塑料覆盖物和纸巾，以降低湿度。第三，浸染后至少5天内不要浇水。
根据特定的质粒构建，转基因植物的筛选方法可能有所不同。如果质粒载体携带赋予对草铵膦铵盐抗性的 Bar（双丙氨膦乙酰转移酶）标记基因，则可直接将种子播种于土壤中，无需对种子进行任何灭菌处理。随后每隔几天用1:1000稀释的草铵...
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致谢
感谢 Chunxin Wang 构建 pTSO2::GUS 载体并提供图1中的照片，感谢 Detlef Weigel 分享 GUS-foolproof 实验方案，感谢 Paja Sijacic 和 Courtney Hollender 提出的有益建议。Z. L. 实验室的研究工作由美国国家科学基金会（IOB0616096 和 MCB0744752）资助。Z.L. 还部分得到了马里兰大学农业实验站的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6-苄基腺嘌呤 | Sigma-Aldrich | 852430 | |
| Silwet-77 | Crompton Corp. | 有毒，操作时佩戴手套 | |
| MS基础培养基（Murashige 和 Skoog 基本培养基） | Sigma-Aldrich | M5519 | |
| Gamborg’s 维生素溶液 1000倍浓缩液 | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚基 β-D-葡糖苷酸环己胺盐） | Biosynth International, Inc | B-7300 | 有毒，避光保存，置于暗处 |
| 3M 微孔胶带 | Fisher Scientific | 19027761 |
参考文献
- Clough, S. J. Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation. Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-735 (1998).
- Wang, C., Liu, Z. Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development. Plant Cell. 18 (2), 350-350 (2006).
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重印与许可
