花浸法转化 拟南芥 用于检查 pTSO2::β-葡萄糖醛酸酶 报告基因表达

摘要

本文介绍了花序浸渍法 Agrobacterium tumefaciens 介导的转化 拟南芥通过引入细胞周期调控的启动子-报告基因系统， pTSO2::β-葡萄糖醛酸酶（GUS），进入 拟南芥我们展示了如何在转基因幼苗中检测GUS报告基因的表达。

摘要

将外源基因导入生物体的能力是现代生物学和生物技术的基础。在模式开花植物中Arabidopsis thaliana，花序浸润转化法^1-2因其简便、高效且成本低廉，已取代所有先前的方法。具体而言，幼嫩开花植株的茎尖Arabidopsis植物被浸入一种溶液中Agrobacterium tumefaciens携带特定质粒构建体。浸染后，将植株放回正常生长条件并收获种子，其中极小部分种子因转入了外源基因，可在含抗生素的培养基上被筛选出来。该花序浸染法极大地促进了Arabidopsis研究极大地促进了我们对植物基因功能的理解。在本研究中，我们采用花序浸润法（floral-dip method）转化一个报告基因，β-葡萄糖醛酸苷酶 (GUS)，在控制下TSO2启动子TSO2，编码核糖核苷酸还原酶（RNR）小亚基³, 是一种在细胞周期中受调控的基因，对细胞周期S期的脱氧核苷二磷酸（dNDP）生物合成至关重要。对该基因的检测GUS转基因中的表达Arabidopsis幼苗显示TSO2在活跃分裂的组织中表达。所报道的实验方法和材料不仅易于应用于科研，也可轻松适用于高中和大学阶段的教育。

方案

I. 花浸法转化 拟南芥

1. 转化前约1个月，播种 拟南芥 将种子播种到4至8个花盆（5英寸方形盆）中，每盆约10-15株植物。对于育性正常的植物，每种质粒构建体种植4盆即可。若需转化突变体 拟南芥 生育力降低时，应相应增加花盆数量。
2. 植物在标准条件下培养（16小时光照，8小时黑暗） 22°C）。如果植物在较短日照或较低温度条件下生长，开花时间会延长，达到适合转化的状态所需时间也会更长。良好的植株管理可确保植株健康，而健康的植株是成功转化的关键。
3. 当植株刚刚抽薹并开始开花时，即可进行转化。为了提高转化效率，在转化前3-4天，一旦主花序抽薹，立即剪除，以促进更多侧枝的形成。转化前一天给植株浇水，以确保土壤在花序浸润过程中不会吸收过多的侵染液。
4. 转化前两天，在含有适当抗生素的40 ml LB培养基中接种（若使用 pTSO2::GUS, 50 μg/ml 卡那霉素）与 农杆菌 根癌农杆菌 携带GV3101菌株的 pTSO2::GUS 构建。该 pTSO2::GUS 克隆于 pBIN20 具有以下特性的载体 NPTII 赋予卡那霉素抗性的基因³. 在28-30°C.
5. 次日，将8ml过夜培养物转移至含LB培养基的400ml中 50 μg/ml ....

讨论

转化效率由多种不同因素决定，这些因素将在下文讨论：

1. 植物的健康状况及其苗龄至关重要。理想材料为约一个月大、带有大量未成熟花蕾的植株。在转化前3-4天剪除主茎以促进侧枝生成，可提高转化效率。较老的植株虽也能获得转化子，但效率较低。
2. 植物的育性非常重要。若需转化育性降低的突变体，则需要准备更多的植株用于浸染。
3. 浸染缓冲液中添加0.3% Silwet L-77表面活性剂被认为是必需的。
4. 植株在浸染液中的浸染时间应至少持续5分钟。
5. 为减少真菌污染，需采取多项预防措施。首先，应在浸染前一天对植株或土壤浇水，避免土壤在浸染过程中吸收浸染液；切勿将土壤浸入浸染液中。其次，浸染后24小时内应移除塑料覆盖物和纸巾，以降低湿度。第三，浸染后至少5天内不要浇水。

根据特定的质粒构建，转基因植物的筛选方法可能有所不同。如果质粒载体携带赋予对草铵膦铵盐抗性的 Bar（双丙氨膦乙酰转移酶）标记基因，则可直接将种子播种于土壤中，无需对种子进行任何灭菌处理。随后每隔几天用1:1000稀释的草铵.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6-苄基腺嘌呤	Sigma-Aldrich	852430
Silwet-77	Crompton Corp.		有毒，操作时佩戴手套
MS基础培养基（Murashige 和 Skoog 基本培养基）	Sigma-Aldrich	M5519
Gamborg’s 维生素溶液 1000倍浓缩液	Sigma-Aldrich	G1019
X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚基 β-D-葡糖苷酸环己胺盐）	Biosynth International, Inc	B-7300	有毒，避光保存，置于暗处
3M 微孔胶带	Fisher Scientific	19027761