记录小龙虾对镜像反射的行为反应

摘要

我们已开发出两种方法，用于在无触觉和化学线索的情况下研究视觉线索对行为的影响。其中一种方法涉及对小龙虾在水族箱中对反光墙壁的反应进行录像；另一种方法则考察由透明隔板后一只活体小龙虾所提供的视觉输入所产生的效应。

摘要

社会行为依赖于视觉、机械和嗅觉系统的感觉输入。一个重要的问题在于每种感觉模式在引导行为中的相对作用。通过将视觉刺激与机械和化学感觉刺激隔离开来，已对视觉输入的作用进行了研究。在一些研究中（Bruski & Dunham, 1987；Delgado-Morales et al., 2004），研究人员使用眼罩或低光照强度去除视觉输入，从而阐明了其余感觉模式的影响。另一种方法是在缺乏任何适当机械和化学感觉线索的情况下研究视觉输入的影响。该方法旨在确定视觉输入的独立作用。

我们采用了两种方法，在不提供化学和机械线索的情况下向小龙虾提供视觉刺激。第一种方法是将小龙虾置于一个水族箱中进行录像，水族箱一半的壁面覆盖镜子以提供反射环境，另一半壁面则覆盖无反射性的（哑光表面）塑料。这使小龙虾可以在反射性和非反射性环境之间进行选择。反射环境能够在小龙虾于水箱一半区域活动时，通过其自身移动的反射影像提供视觉线索；而水箱的非反射性一半区域则缺乏此类视觉线索。另一种方法是将小龙虾置于一个水族箱中进行行为录像，水族箱两端各设有一个较小的隔间，其中一个隔间内放置一只小龙虾以提供视觉线索，而另一端隔间内放置一个静止的非生物物体，以提供来自非移动、非小龙虾来源的视觉输入。

我们已发表的研究结果表明，小龙虾对反射环境的反应取决于其社会化程度和社会等级。经过社会化的小龙虾在反射环境中停留的时间更长，并且在该环境中表现出某些行为的频率高于非反射环境；而隔离饲养的小龙虾则未表现出此类差异。以同性别成对饲养的小龙虾会形成优势或从属的社会等级。优势个体与从属个体对反射的反应存在差异（May & Mercier, 2006; May & Mercier, 2007）。优势小龙虾在反射侧停留的时间更长，进入反射角落的次数更多，在反射角落停留的时间也比非反射侧更长。从属小龙虾在反射侧倒退行走的频率高于非反射侧。初步数据表明，来自相邻小隔室中小龙虾提供的视觉线索可能产生类似效应（May et al., 2008）。

方案

1. 社会化

1. 为消除已存在的社会等级，每只小龙虾被单独饲养在独立的塑料容器中（30 cm 长 × 17.5 cm 宽 × 13 cm 深），容器内装有经过过滤并充氧的水，并放置一个小的塑料花盆作为庇护所。若使用透明容器，则在各容器之间放置隔板（例如纸巾），以确保小龙虾在视觉上相互隔离。
2. “隔离”组的小龙虾继续单独饲养额外 3 至 14 天。每周换水三次，并喂食三次。
3. 为建立社会等级，小龙虾在初始隔离期后被配对放入同一性别组合中。对每只小龙虾进行称重，并测量其体长（从额角至尾节）；配对个体的体重和体长差异控制在 10% 以内。使用白色丙烯酸颜料在每只小龙虾的头胸甲上标记以区分个体（通常在一个个体上标记一个点，另一个个体上标记一条线）。
4. 经过 30 分钟的静置期后，将每对小龙虾放入一个洁净的白色塑料容器中（48 cm 长 × 25 cm 宽 × 13 cm 深），容器中注入半满的经过过滤并充氧的水（室温）。该互动过程可通过连接录像机的摄像机记录在 VHS 录像带上，或通过网络摄像头记录在计算机中。此次互动用于建立支配等级关系。
5. 初次互动后，每对小龙虾被共同饲养在一个更大的塑料容器中（58 cm 长 × 30 cm 宽 × 35 cm 深），持续额外 3 至 14 天。该容器通过过滤系统提供循环水。容器内提供一根 PVC 管（约 10 cm 长）作为庇护所。

2. 测试水族箱的构建与对照组设置

方法一

1. 为了观察动物对反射环境的反应，使用一个玻璃或有机玻璃水族箱（52 cm 长 × 25 cm 宽 × 30 cm 高）（图 1）。
2. 在水族箱一端放置一面镜子（25 cm 长 × 20 cm 高），并用胶水或固定蜡固定。在两侧各放置一面镜子（26 cm 长 × 20 cm 高），使其与末端的镜子相接，并用胶水或蜡固定。
3. 其余的箱壁覆盖哑光表面的窗膜。该膜可消除反光，但不会干扰光照条件。可能需要对膜进行轻微打磨，以确保其完全无反光性。

方法二

4. 为了研究对活体小龙虾（“源小龙虾”）提供的视觉刺激的反应，使用一个带有两个端室的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）水族箱（图2）。该水族箱包含一个较大的中央隔室（48 cm 长 × 26 cm 宽 × 26 cm 高）和两个尺寸相同的较小端部隔室（12 cm 长 × 26 cm 宽 × 26 cm 高）。端部隔室与中央隔室之间由透明的聚甲基丙烯酸甲酯板分隔，且密封处理，以防止水体和化学信号在各隔室之间传递。
5. 整个水族箱的外周覆盖有无反光的哑光塑料，仅保留两端的隔板保持透明。
6. 作为对照，使用油泥（如Sculptee）制作的立方体来提供来自惰性物体的视觉输入。该立方体（3.5 cm × 3.0 cm × 3.3 cm）体积与源小龙虾相近，并被涂成相似的红色。

3. 视觉训练

方法一

1. 在打斗发生后的3至14天内，将小龙虾置于镜面/哑光水箱中进行录像，以确定其优势地位。
2. 将每只小龙虾单独放入一个含有充气过滤水和一个用作庇护所的塑料花盆的乐扣容器中。将小龙虾带至测试房间，并在测试前给予30分钟的适应时间。
3. 测试水族箱的一半内壁贴有镜子，另一半内壁贴有无反射性的塑料材料，并注入充气过滤水，水深约20 cm。
4. 通过音频/视频线缆将数码相机连接至VHS录像机，并将相机置于水族箱上方足够高的位置，以确保能够完整拍摄整个水族箱。视频被记录在VHS磁带上。或者，也可使用连接至计算机的网络摄像头，通过视频制作软件进行录制，并将视频存储在DVD上。
5. 将一对小龙虾中的一只轻轻放入水族箱中央（使用花盆操作），并记录其20分钟内的活动情况。录制期间测试房间内无人在场，以减少额外视觉和听觉输入的干扰。应尽一切努力确保录制环境安静。
6. 测试结束后，移走小龙虾，排空水族箱，冲洗后重新注水。
7. 为平衡实验条件，将水族箱旋转，使镜子位于房间的相反一侧。此举有助于消除可能引起小龙虾偏好水族箱某一侧的未知因素影响。
8. 随后，以相同方式对这对小龙虾中的第二只进行测试。

方法二

9. 如方法一中所述，将螯虾带入测试室，并使用相同的录像设备进行录像。
10. 所有区域（中间测试区和两个端区）均注入充气过滤水，水深约 20 cm。
11. 将一只与待测螯虾体型相近的螯虾放入一个端区，对照立方体则放入另一端区。
12. 利用花盆状庇护所，将待测螯虾轻柔地放置于水族箱中央，并持续录像 20 分钟。
13. 测试结束后，排空水族箱，冲洗后重新注满水。
14. 在测试配对中的第二只螯虾之前，需将源螯虾和对照立方体转移至相对的端区，以平衡实验条件。

4. 视觉刺激反应的分析

方法一

1. 为确保实验者对小龙虾的社会地位保持盲态，在分析争斗行为试验之前，先分析其在镜面/哑光水族箱中的行为。
2. 记录小龙虾在水族箱每一侧所花费的时间。当螯足基节越过水族箱中线时，即视为小龙虾从一侧移动到另一侧（图3）。
3. 同时记录转角、转向、穿越、静止不动和倒退行走等行为的发生频率（行为描述见表1）。
4. 使用配对t检验，对每个社会群体在水族箱反射侧与非反射侧所表现出的行为进行比较。

方法二

5. 与方法一相同，在分析争斗试验之前，先分析螯虾行为的录像。
6. 记录螯虾在水族箱任一侧所花费的时间，记录方式如方法一所述。
7. 记录角落行为、对端而立、转身、穿越、举身和倒走行为的发生频率（表1）。
8. 针对每个社会群体，使用配对t检验比较在供体螯虾侧发生的行为与在对照立方体侧发生的行为。

5. 打斗行为分析

1. 配对后最初30分钟内的争斗行为录像将被回放并进行评分。每次30分钟的录像包含多个对虾通过螯足和/或触角发生接触的对抗事件。在这些对抗中，螯足通常用于推挤、击打或抓握对手，触角有时用于抽打对手。一只对虾可能试图将对手翻转并按压在底部。每次对抗以其中一只对虾后退行走或弹动尾扇实现“逃逸游泳”而结束。
2. 记录下每次对抗事件的数量，并记录每次对抗中后退的一方对虾的身份（通过胸节上的颜料标记确定）。在每次30分钟记录中，输掉大多数对抗的对虾被判定为失败者，另一只对虾则被判定为胜利者。

6. 代表性结果

在30分钟的争斗期间，所有个体对都会表现出争斗行为。这些行为包括触角轻拍、扑击、推挤、抓握、螯足击打以及将对手翻转，如其他文献所报道（例如 May & Mercier 2006, 2007）。最终，每对小龙虾中会有一个个体持续后退并避免进一步接触。该后退的个体被判定为失败者，等级定为从属；而获胜的个体则被定为优势等级。

在整个配对共养期间，可通过观察饲养箱中螯虾的行为来监测其等级，饲养箱内仅提供一个塑料管作为庇护所。优势个体 invariably 占据庇护所，而从属个体则不会进入。从属个体常以螯足并拢并向前伸展的姿势行走，而优势个体通常以螯足抬高且分开较远的姿势行走（Guiasu & Dunham, 1998）。当向饲养箱中添加新食物时，优势个体通常优先取食。在我们对 P. clarkii 的研究中（例如 May & Mercier 2006, 2007），连续配对三天后通常不再发生等级逆转。

在极少数情况下，配对期结束前其中一只个体可能会死亡。当配对期较长（例如14天）且小龙虾在体型或体重上过于接近时，更易发生此类情况。因此，保持约10%的体重差异可避免死亡事件。若配对中有一只个体死亡，则另一只个体的数据不纳入研究分析。

优势个体和从属个体的小龙虾对反射环境通常表现出不同的反应。优势个体的小龙虾在反射侧停留的时间明显更长，而从属个体和隔离饲养的个体则没有这种倾向（May & Mercier, 2006, 2007）。此外，优势个体在反射侧表现出更频繁的转角和转向行为，而在非反射侧则较少出现此类行为；但从属个体和隔离个体通常不具备这一特征。然而，优势与从属个体之间的这些差异并非立即形成，而是在为期3至14天的配对期中逐渐发展建立的（May & Mercier, 2007）。

初步证据表明，在配对3天后，优势个体和从属个体螯虾对活体螯虾（源螯虾）提供的视觉线索反应不同（May 等，2008）。优势螯虾在有源螯虾的一侧花费更多时间，并在该侧角落停留更久，而从属螯虾在两侧之间则未表现出此类差异。

行为	描述
转弯	背对水族箱角落，双螯尖端分别接触两面侧壁，并在此位置保持至少5秒（图4）
端面	至少用一个螯足的末端触碰水箱一端的池壁，并保持面向池壁至少 5 秒（图 5）
转向	将行走路径方向从顺时针改为逆时针或 反之亦然 （图6）
杂交	离开水族箱边缘，行走至至少一个体长距离的其他任意侧壁（图7）
倒走	向后行走至少一个体长的距离
冷冻	至少5秒内所有可见运动（包括附肢和触角的运动）突然停止
后肢站立	利用第四和第五对步足站立，同时将胸部腹面抵住墙壁，并至少将一条步足置于墙壁上

表1. 克氏原螯虾（P. clarkii）在测试水箱中央区域表现出的行为。

图 1. 方法 I 中所用鱼缸的示意图。鱼缸的一半内壁贴有镜子，另一半内壁贴有无反光塑料。

图2. 方法II中所用 aquarium 的示意图。该水箱包含一个中央区域，用于放置待测小龙虾，以及两个末端隔间，由完整的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）屏障分隔。在一个末端隔间中放入一只活体小龙虾，另一个末端隔间中放入一个立方体作为对照。

图3. 实验水族箱示意图，中线以垂直虚线表示。当螯足的基节越过中线时，即视为小龙虾从一侧移动至另一侧。

图 4. 小龙虾在转弯时位置的示意图。注意两个螯足的尖端分别接触不同的器壁。

图5. 示意图显示小龙虾面向端壁时的位置。注意两只螯足均接触同一侧壁面。

图6. 示意图显示转向行为。运动方向的反转构成一次转向。转向可发生在角落处（例如从方向1转向方向2，或从方向4转向方向5），也可发生在侧边（未显示）。进入角落和离开角落时方向相同（例如从方向1到方向3）则不视为一次转向。

图7. 显示穿越行为的示意图。当小龙虾离开一个池壁并移动到另一个池壁，且与最近池壁的距离至少为一个体长时（箭头所示），即发生穿越行为。

图8. 显示举身行为的照片。小龙虾以后两对步足站立，并将身体抬起紧贴墙壁，至少有一对步足与墙壁接触。

讨论

优势个体小龙虾在反光环境中停留时间更长，这一观察结果表明，它们能将反射影像识别为同种个体，并且视觉线索足以引发其接近行为。使用活体小龙虾代替反射影像所得出的类似结果也支持这一解释。从属个体和隔离饲养的小龙虾均未表现出对反光环境的偏好，且从属个体对活体小龙虾的兴趣也不高于对立方体的兴趣。因此，小龙虾对视觉线索的反应取决于其优势等级。目前尚不清楚小龙虾是特别被小龙虾的图像吸引，还是被运动所吸引。尽管如此，仍可通过使用镜子以及透过透明隔板呈现的图像来探究视觉输入的作用，并识别相关的视觉线索。

先前的研究结果表明，经过仅30分钟的配对后，优势个体与从属个体的小龙虾对反射表面的反应基本相同；而在配对3至14天后，行为差异逐渐显现，这是由于失败个体的行为发生了改变（May & Mercier, 2007）。因此，个体在视觉线索刺激下所表现出的行为既取决于互动的结果，也取决于社会交往的持续时间。已知赢得或输掉争斗性互动会影响未来互动的成功率，获胜会增加再次获胜的可能性，而失败则会提高后续失败的概率（Hsu & Wolf, 1999）。失败的小龙虾在视觉线索下所表现出的行为可塑性，其潜在机制可能...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
单室测试水箱	Brock University Machine Shop
端室测试水箱	Brock University Machine Shop
隔离容器	Rubbermaid		盖子上有尺寸为 30 cm × 17.5 cm × 13 cm 的孔，以便在盖上盖子时允许空气和光线通过
争斗实验舱			48 cm × 25 cm × 13 cm
社会性饲养舱			58 cm × 30 cm × 35 cm
小型塑料花盆			用作庇护所
Coolpix 4500 相机	Nikon Instruments
T120 录像带录像机	RCA
计算机			Windows Movie Maker 或其他视频采集软件
网络摄像头	Logitech
油性黏土	Sculptee		用于制作对照立方体
红色乳胶漆	FolkArt		用于制作对照立方体
水性清漆	FolkArt		用于制作对照立方体