数字微镜装置（DMD）能够生成复杂的时间和空间光图案，用于控制神经元的兴奋性。本文讨论了DMD系统的设计、构建和操作中的相关问题。此类系统已成功实现了对远端树突分支点间非线性整合的验证。
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方法文章
利用数字微镜装置进行模式化光刺激以研究树突分支点处的整合功能
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摘要
摘要
光是一种多功能且精确的调控神经元兴奋性的手段。近年来，光敏效应分子如通道视紫红质（channel-rhodopsin）和笼锁型神经递质（caged neurotransmitters）的引入，激发了人们对开发更优方法以在空间和时间上精确控制光模式的兴趣，这些方法在实验神经科学中具有重要应用价值。一种传统策略是在共聚焦和双光子显微镜中采用的方法，即将光聚焦到一个衍射极限的光斑，然后依次扫描该光斑覆盖目标区域。当需要在短时间内刺激较大区域时，这种方法会遇到困难，这一问题在光刺激实验中比在成像中更为突出。另一种替代策略是借助数字微镜装置（DMD）将完整的空间光模式投射到目标区域。DMD方法具有吸引力，因其硬件组件相对便宜，并且有商业支持。由于目前尚无适用于直立显微镜的现成DMD系统，本文将讨论此类DMD系统构建与操作中的关键问题。尽管我们主要描述的是用于紫外光解（UV photolysis）的系统构建，但也会提供构建更为简单的可见光系统以用于光遗传学实验的修改方案。该紫外光解系统已被用于开展神经科学中一个基础问题的研究：空间分布的输入信号如何在远端树突分支点之间进行整合。实验结果表明，这种整合在分支点之间可能呈现非线性特征，且超线性整合主要由NMDA受体介导。
方案
一般设计考虑
如果光刺激的波长位于可见光范围内，例如在光遗传学实验中，系统的光路布局将比紫外光解实验简单得多。此时只需从各显微镜厂商处购买双相机接口模块即可。数字微镜装置（DMD）平面可被放置在两个相机接口中任意一个的共轭像平面位置上。但在紫外光解实验中，来自DMD的光必须通过落射式照明光路引入（图3A），因为目前所有商用显微镜中通往相机的成像管镜均未针对紫外波长进行校正。在350 nm波长下，成像管镜的球面像差严重，导致无法将光聚焦成一个精细的光斑，也无法实现足够的空间分辨率。这一问题在共聚焦显微镜中不会出现，因为在沿相同光轴引入准直激光束时，管镜会被移除。通过落射荧光光路引入紫外光可解决该问题，因为该路径中的管镜均在一定程度上对紫外波长下的球面像差进行了校正。关于显微镜光学系统，我们可以根据期刊的要求进行任意深度的阐述。科学界普遍对此类主题兴趣浓厚，但目前能够清晰讲解这一内容的资料来源尚不多见。
为了尽量减少对显微镜的改造，并考虑到落射荧光单元空间有限，将数字微镜器件（DMD）置于由中继透镜新创建的共轭像平面处（指出DMD单元相对于显微镜的位置）。选用了一款商用的紫外校正中继透镜（Specialty Optics）（在图示和显微镜上标出该透镜的位置）。
DMD的光照
当接收到二进制输入信号后，微镜可在相对于芯片平面正负12°的倾斜角度之间切换。旋转轴沿每个微镜对角顶点方向（与芯片边沿成45°角）。微镜旋转方向由芯片正面某一角落处的金色三角形标记标示。微镜的倾斜角度决定了入射照明光束的俯仰角（pitch）和方位角（azimuth）的对准方式。照明光束的俯仰角需与DMD芯片的垂直轴成24°，而方位角需垂直于微镜的旋转轴。精确的光束对准对于系统的高效运行至关重要。在我们设计的原型系统中，采用了多种手动倾斜调节机构，以校正设计和加工中的不足。这导致系统体积明显大于实际所需。也可采用其他更紧凑的结构来引入照明光（若认为有必要，可展示替代设计方案）。
进行光解实验需要使用激光光源，以产生高强度聚焦光束，从而实现快速解笼。对于不需要高强度精确聚焦光的光遗传学实验，则可采用非相干光源。本文所述的光解实验中，我们使用了一台准连续二极管泵浦固态（DPSS）三倍频 NdVO4 激光器（1 W，355 nm）。（关于光解实验中光源选择的详细讨论，请参见参考文献2）。本实验需要相对高功率的激光器，因为在使用数字微镜器件（DMD）系统时，仅有激光输出的一小部分实际传递到样品上。传递到样品上的光量与激光光束照射区域内处于“开启”与“关闭”状态的微镜数量之比成正比。
如果需要使用激光光源，最好将激光输出端连接至多模光纤，以便于将光束精确地定位并沿正确轴向对准数字微镜器件（DMD）进行照明。通过光纤传输光可解决第二个问题，即如何消除相干照明固有的散斑图案。该光纤缠绕在一个压电光纤拉伸器（型号 915，Canadian Instrumentation & Research, Ltd）上，并以约 40 kHz 的频率振荡。（在实验装置中标注此部件）光纤的微观拉伸足以在每次光刺激脉冲的毫秒级持续时间内使散斑图案快速移动多次，从而有效消除散斑效应。随后，利用紫外显微物镜（Olympus DApo20UV）对光纤输出光进行准直。（在装置中标注此部件）图 3B 展示了系统的光学分辨率校准结果。图 3C 显示了通过光刺激点位置变化下的电流幅值所测得的有效生理分辨率。图 3D 展示了不同强度光刺激引发的电流反应。
系统的操作：
将CCD像素与DMD微镜共配准
编写了一款内部软件，用于确定数字微镜器件（DMD）中各个微镜与成像CCD相机特定像素之间的对应关系。该软件中的图形用户界面（GUI）允许用户将DMD微镜分配给由鼠标标记的CCD图像上的特定区域。因此，只需将光标移至计算机屏幕上显示的图像并点击标记感兴趣的区域，即可完成光刺激位置的标记。（计算机屏幕上将显示一幅树突分支的荧光图像。学生将在计算机屏幕上的图像中标记多个位置。）
设定光递送的模式
操作员在计算机屏幕上标记的图案被存储为一系列独立的图像。随后，每个空间图案对应的激光脉冲时序被编程输入至与数据采集程序（pClamp）集成的软件中。（演示此过程）。
协调激光脉冲与DMD图案
数据采集程序启动并协调DMD电子器件的时序、激光的门控，以及从目标神经元获取膜片钳电信号的过程。（在计算机上模拟此序列）
实验数据：
远端树突分支点的非线性整合
传统的树突整合电极实验通常通过在离散位置改变刺激强度来实现，而不是在保持刺激强度恒定的同时扩展刺激区域。电发生饱和以及位置依赖性通道的激活等问题可能影响实验结果与结论。使用基于数字微镜器件（DMD）的系统可轻松实现树突的分布式刺激（图4A）。通过增加光刺激光斑的数量来调节输入强度。可以看出，跨分支点的空间整合可能是非线性的，并且随着两个子分支上输入强度的增加，其整合效应逐渐呈现超线性特征。这种超线性效应主要由NMDA受体介导，而非电压门控通道所致（图5）
代表性结果
图1. DMD中微镜的操作。（侧视图）作用于单个镜面的静电力使镜面相对于水平方向向两个可能的方向之一倾斜12°。在“开启”位置，入射光束沿垂直于芯片表面的光轴方向反射；在“关闭”位置，入射光束偏离光轴48°。照射到镜面之间微小间隙的光束则偏离光轴24°。（顶视图）镜面的倾斜方向相对于镜面和芯片的边沿呈45°。
图 2. 现代荧光显微镜的基本结构。滤光立方体位于物镜与管镜之间的“无限远空间”中。存在一条通向相机的成像光路，以及一条将光引导至样品的照明光路。这两条光路所用的管镜在设计和焦距上通常不同。用于照明光路（而非成像光路）的管镜设计适用于紫外光谱范围内的工作。
图3. 基于紫外光的DMD系统布局。如果照明光源位于紫外光谱范围内，则必须通过专为紫外光校正的管镜引入。成像光路中的管镜并未针对紫外光设计，因此需要一个中继系统以创建一个易于接近的共轭像平面。显微镜中不同的共轭像平面由红色虚线标示。某一像平面上的明亮图案会被投射到其他共轭平面上。在成像过程中，样品平面上的图案被投射到探测器/相机上；而在照明过程中，由DMD生成的图案则被投射到样品上。
图4. 可见光DMD投影系统的布局。如果照明光处于可见光范围，可将DMD生成的光图案导入成像光路中。通过商用双相机接口附件和合适的二向色镜即可轻松实现。
图 5. 系统的横向分辨率。（A）在荧光靶标上的光学分辨率为 ~2 μm。（B）通过在树突上光解笼锁型谷氨酸所测得的有效分辨率为 ~5 μm。分辨率距离的增加是由于谷氨酸的扩散以及树突有限宽度共同造成的。（C）光解过程可模拟突触事件的动力学特性。电压钳制下的电流响应簇是由递送到树突的光能量变化所引起的。
图 6. 树突分支点处的非线性叠加。 （A）分别在两条树突分支上施加分布输入。其相应的电压响应如下所示。（B）随后同时施加刺激。测得的响应（红色迹线）与两个单独响应的算术和（灰色迹线）不同。
图 7. 超线性叠加依赖于NMDA受体。(A) APV（一种选择性NMDA受体拮抗剂）阻断了超线性叠加效应。(B) 绘制了刺激强度关系及其对NMDA受体拮抗剂的敏感性。
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讨论
基于DMD的光刺激方法的优势在目标区域相对较大时最为明显。如果感兴趣的目标非常小，例如少数几个树突棘，则顺序扫描共聚焦和双光子系统可能是更合适的方法。DMD方法的一个显著缺点是其对可用光源的利用效率较低，大部分可用光必然被导向“关闭”状态的微镜而未被利用。
基于DMD的系统最适合在可见光范围内运行。我们预计，基于DMD的光刺激系统在与光遗传学实验结合使用时将产生重要影响。
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致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）的RO1项目、退伍军人事务部研究服务的杰出研究评审项目对C.-M. T.的资助，以及对C.W.L.的个人国家研究服务奖（NRSA）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 现代直立式荧光显微镜 | |||
| CCD相机及图像采集软件 | |||
| 计算机及数据采集/接口系统 | |||
| DLP Discovery 开发套件 | |||
| ALP3 USB 接口 | |||
| S2 + 光学组件（带LED） | |||
| 双相机接口单元 | |||
| 355 nm 三倍频 NdVO4 激光器（约 1 W） | DPSS Laser Inc. | ||
| 激光快门 Model LS6 | Uniblitz | ||
| 多模光纤及光纤拉伸器 Model# 915 | Canadian Instrument and Research, Ltd | 100 μm 芯径多模光纤 | |
| 多模光纤耦合器 | Oz Optics | ||
| 信号发生器 | 最高 50 kHz | ||
| 光束准直器 | Olympus Corporation | DApo20UV340 | |
| 紫外中继透镜 | Special Optics | #: 54-25-60-355 |
参考文献
- Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930-939 (2009).
- Tang, C. Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery. Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).
- Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated. Nature. 456, 826-827 (2008).
- Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V. Holographic photolysis of caged neurotransmitters. Nature Methods. 5, 821-827 (2008).
- Hornbeck, L. J. Digital Light Processing and MEMs: An overview. , Texas Instrument White Papers. Forthcoming.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points
Posted by JoVE Editors on 3/24/2011. Citeable Link.
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