由功能化微管在表面附着的驱动蛋白马达上滑行所构成的分子穿梭系统，可作为一种纳米级运输系统。本文描述了一种典型穿梭系统的组装方法。
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摘要
摘要
细胞已经进化出复杂的分子机制，例如驱动蛋白马达蛋白和微管丝状结构，以支持细胞内物质的主动运输。驱动蛋白的尾部结构域可结合多种货物，而其头部结构域则利用储存在ATP分子中的化学能，沿微管晶格逐步移动。这些长而刚性的微管为细胞内长距离运输提供了轨道。
这些分子马达和微丝也可用作微加工合成环境中分子穿梭系统的组分1。在一种常用设计中，驱动蛋白马达通过其尾部锚定在轨道表面，而经过功能化的微管则作为由这些马达推动的运载元件。这些穿梭系统可通过生物素与链霉亲和素之间强效且特异性的结合来装载货物。关键组分（生物素化微管蛋白、链霉亲和素和生物素化货物）均可从商业途径获得。
在经典倒置运动性实验2的基础上，本文详细描述了分子穿梭装置的构建。将驱动蛋白马达蛋白吸附到预先涂有酪蛋白的表面；微管由生物素标记的微管蛋白聚合而成，附着于驱动蛋白后，再用罗丹明标记的链霉亲和素进行包被。通过将ATP浓度维持在未达到饱和的水平，使微管滑行速度达到适合装载货物的最佳状态3。最后，加入生物素化且荧光素标记的纳米微球作为货物。当滑行的微管与附着在表面的纳米微球发生碰撞时，纳米微球便会附着到微管上。
该方案可轻松修改，用于装载多种货物，例如生物素标记的DNA4、量子点5，或通过生物素标记的抗体装载多种抗原4-6。
方案
1）缓冲液与试剂
这些溶液应提前配制，并分装成方便使用的等份量储存。每份等份量应包含一次典型实验所需的足够溶液，且每次运动性检测均应使用新鲜的等份样品。以下方案中也注明了储存条件和典型的分装体积。
1. BRB80 缓冲液（80 mM PIPES，1 mM MgCl2，1 mM EGTA，溶于去离子蒸馏水（dd水），用KOH调节pH至6.9）
- 用去离子水配制100 mL 0.5 M EGTA储备液，用2 M NaOH溶液调节pH至7.0。
- 用去离子水配制100 mL 1 M MgCl2储备液，溶液经高压灭菌。
- 将24.2 g PIPES和3.1 g KOH颗粒加入约800 mL去离子水中，搅拌至溶解。用1 M KOH溶液调节pH至6.9。加入2 mL 0.5 M EGTA储备液和1 mL 1 M MgCl2储备液，用去离子水定容至1000 mL。
- 分装至50 mL离心管中，于-20°C冷冻保存以备后续使用。正在使用的BRB80溶液可于4°C或室温保存。
2. 氯化镁，MgCl2（dd 水中 100 mM）
- 用双蒸水稀释，配制成终浓度为 100 mM 的溶液。
- 分装至 0.5 mL 微量离心管中，每管 10 μL，于 -20 °C 保存以备后续使用
3. 鸟苷-5'-三磷酸二钠盐，GTP（dd水配制，25 mM，用NaOH调节pH至7）
- 称取适量并溶于双蒸水中，用 2 M NaOH 溶液调节 pH 至 7。
- 通过测量 260 nm 处的紫外吸光度验证浓度。（使用消光系数 11.7 x 103 M−1cm−1）。
- 分装（每份 10 μL）至 0.5 mL 微量离心管中，于 -20 °C 保存以备后续使用。
4. 二甲基亚砜，DMSO
- 分装（每份10 μL）至0.5 mL微量离心管中，于-20 °C保存以备后续使用。
5. 紫杉醇（1 mM，DMSO 中）
- 在通风橱中称量并用DMSO溶解，配制成终浓度为1 mM的溶液。
- 分装（每管20 μL）至0.5 mL微量离心管中，于-20 °C保存以备后续使用。
6. D-(+)-葡萄糖（dd 水中 2 M）
- 称取并溶解于双蒸水中，配制成终浓度为 2 M 的溶液。
- 分装至 0.5 mL 微量离心管中，每管 20 μL，于 -20 °C 保存以备后续使用。
7. 葡萄糖氧化酶（2 mg/mL，溶于 BRB80）
- 用BRB80溶解，配制成终浓度为2 mg/mL的溶液。
- 分装至0.5 mL微量离心管中（每管20 μL），于-20 °C保存以备后续使用。
8. 二硫苏糖醇，DTT（dd 水中配制成 1 M）
- 在通风橱中用去离子水溶解，配制成终浓度为 1 M 的溶液。
- 分装至 0.5 mL 微量离心管中，每管 20 μL，于 -20 °C 保存以备后续使用。
9. 过氧化氢酶（0.8 mg/mL，溶于BRB80缓冲液）
- 分至少两个阶段将样品溶解于BRB80中，最终浓度为0.8 mg/mL。通过测量276 nm和406 nm处的紫外吸光度确定每个阶段的浓度（276 nm处的消光系数为3.1 × 105 M-1 cm-1，406 nm处为2.2 × 105 M-1 cm-1，使用公式A = cL）。
- 分装（每份20 μL）至0.5 mL微量离心管中，于-20 °C保存以备后续使用。
10. 腺苷-5'-三磷酸（ATP）（100 mM，溶于 100 mM MgCl2 中）
- 用去离子水配制 100 mM MgCl2 储存液。称取干燥粉末，溶解于该储存液中，以获得 100 mM 的终浓度。
- 通过测量 260 nm 处的紫外吸光度验证浓度。（使用消光系数 15.4 × 103 M−1cm−1）。
- 分装（每份 20 μL）至 0.5 mL 微量离心管中，于 -20°C 保存以备后续使用。
11. 酪蛋白溶液（BRB80 中含 20 mg/mL 酪蛋白）
- 在50 mL离心管中，将约3 g酪蛋白加入30 mL去离子水中，涡旋混合约1小时，直至溶液形成较稠的质地。
- 在约15000 g条件下离心30分钟，用0.5 μm和0.2 μm针头滤器过滤上清液。
- 通过测定280 nm处的紫外吸光度确定上清液浓度（使用消光系数0.67 mL mg-1 cm-1），然后用BRB80缓冲液稀释至20 mg/mL。
- 分装（每管20 μL）至0.5 mL微量离心管中，于-20 °C保存以备后续使用。
2.）标准溶液
这些溶液需在实验当天配制，实验结束后应予以丢弃。每种配制1 mL。
1. BRB80CS0.5
- 将酪蛋白溶液用BRB80稀释至终浓度为0.5 mg/mL，并置于冰上保存。该溶液在驱动蛋白之前引入流动池，有助于驱动蛋白吸附到表面后保持其活性。
2. BRB80CA
- 用 BRB80 缓冲液配制 0.2 mg/mL 的酪蛋白和 1 mM ATP，置于冰上保存。在将驱动蛋白引入流动池之前，用此溶液进一步稀释。
3. BRB80T
- 将紫杉醇溶液用BRB80稀释至终浓度为10 μM，并在室温下保存。该溶液用于稳定微管。
4. BRB80CT
- 在BRB80缓冲液中配制10 μM紫杉醇和0.2 mg/mL酪蛋白，室温保存。该溶液用于进一步配制抗荧光淬灭剂和微管溶液。
5. BRB80AF
- 在BRB80CT缓冲液中配制20 mM D-葡萄糖、20 μg/mL葡萄糖氧化酶、8 μg/mL过氧化氢酶、10 mM DTT和20 μM ATP，室温保存。该溶液用于稀释链霉亲和素和纳米球，并在流动池中“洗去”多余的链霉亲和素。通过调节该溶液中的ATP浓度，可控制驱动蛋白的运动速度。
3）驱动蛋白制备
- 表达包含野生型全长的驱动蛋白构建体 Drosophila melanogaster 驱动蛋白重链及C端His标签在大肠杆菌中表达，并按所述方法使用Ni-NTA柱进行纯化 6.
- 分装（10 μL 每个样品置于0.5 mL微量离心管中，于-80℃保存80°C 以供后续使用。这些等分试样中活性驱动蛋白的浓度约为 200 nM。7
- 对于典型实验，用 BRB80CA 将驱动蛋白溶液稀释 20 倍。将该溶液标记为 KIN20，并置于冰上保存。
4.）微管制备
- 在0.5 mL微量离心管中，配制25 μL聚合反应液：含4 mM MgCl2、1 mM GTP和5% DMSO（v/v）的BRB80缓冲液。
- 取6.25 μL上述溶液加入一份20 μg冻干的生物素化微管蛋白中。
- 涡旋混匀后，置于37°C水浴中孵育30分钟以促进聚合。用BRB80T缓冲液稀释100倍，轻轻涡旋混匀。将该溶液标记为MT100，并于室温保存。
- 用BRB80AF缓冲液将MT100溶液稀释10倍，标记为MT1000。
5）链霉亲和素和纳米球溶液
在 BRB80AF 中配制浓度为 100 nM 的 AlexaFluor568 标记链霉亲和素。标记为 STV100，并置于冰上保存。同样，将纳米球在 BRB80AF 溶液中稀释 5000 倍。标记为 NS5000，并置于冰上保存。
6）流动池构建
使用两张玻璃盖玻片和双面胶带构建一个流动池。该流动池长约2 cm，宽约1 cm，高约100 μm，体积约为20 μL。通过移液枪从一侧向流动池中加入溶液，并用滤纸从另一侧通过毛细作用将液体吸出。
7.）倒置实验组装
首先用酪蛋白对玻璃表面进行包被，以使驱动蛋白在吸附后仍能保持其功能活性。吸附驱动蛋白后，引入由驱动蛋白固定的微管。随后用荧光标记的链霉亲和素对微管进行包被。洗去多余的链霉亲和素后，加入生物素化的聚苯乙烯荧光素纳米微球（直径40 nm）。表面吸附的静止纳米微球与运动的微管发生碰撞，并被装载到微管上（图1）。
以下列出了各溶液的添加顺序以及在引入下一种溶液前的孵育时间。
- BRB80CS0.5，5 分钟
- KIN20，5 分钟
- MT1000，5 分钟
- STV100，5 分钟
- BRB80AF，3 次
- NS5000
8.）显微镜观察
在引入纳米球后，立即将流动池安装到显微镜载物台上。本实验使用配备100倍油镜（数值孔径1.45）、X-cite 120光源（EXFO，加拿大安大略省）和iXon EMCCD相机（ANDOR，美国康涅狄格州South Windsor）的Eclipse TE2000-U荧光显微镜（Nikon，美国纽约州Melville）。使用FITC滤光立方体（#48001）和TRITC滤光立方体（#48002，Chroma Technologies，美国佛蒙特州Rockingham）分别对流动池底面的纳米球和微管进行成像。曝光时间为0.2秒，两次曝光间隔为2秒。
图1. 分子穿梭系统的示意图。
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讨论
经过少量修改后，多种研究团队已成功采用本方案构建基于驱动蛋白-微管的运动性检测体系。最终运动溶液中的 10 mM DTT 可替换为 0.5% β-巯基乙醇。标准溶液（BRB80AF、KIN20 和 MT1000）若存放超过 2 小时则不应使用。任何含有紫杉醇的溶液，尤其是含有微管的溶液，切勿置于冰上。流动池过度暴露于紫外激发光下会导致功能组分（微管和驱动蛋白）发生光损伤8。若流动池中含有高氧扩散性的聚合物（如聚苯乙烯纳米微球），该效应尤为显著9。
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致谢
我们非常感谢Jonathon Howard，他的研究团队开发了滑动运动测定实验的基本方案，我们在此基础上进行了后续改进。感谢美国国家科学基金会（NSF）资助项目DMR0645023提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 腺苷-5’-三磷酸 (ATP) | Invitrogen | A1049 | |
| 生物素标记微管蛋白 | Cytoskeleton, Inc. | T333 | |
| 酪蛋白 | Sigma-Aldrich | C-0376 | |
| 过氧化氢酶 | Sigma-Aldrich | C-9322 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G-7528 | |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | |
| 二硫苏糖醇 (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | |
| 乙二醇双(2-氨基–乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸 (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| FluoSpheres 生物素化微球，40 nm，黄绿色荧光 (505/515) | Invitrogen | F-8766 | |
| 葡萄糖氧化酶 | Sigma-Aldrich | G-7016 | |
| 鸟苷-5’-三磷酸 (GTP) | Roche Group | 106399 | |
| 氯化镁 (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| 紫杉醇 (Paclitaxel, Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | |
| 1,4-哌嗪二乙磺酸，哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)，哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| 氢氧化钾 (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | |
| 氢氧化钠 (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | |
| 链霉亲和素 Alexa Fluor 568 偶联物 | Invitrogen | S11226 |
参考文献
- Agarwal, A., Hess, H. Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science. Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).
- Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).
- Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles. Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).
- Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins. Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).
- Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins. Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).
- Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes. J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).
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