通过限制性内切酶介导的整合与核移植技术生产转基因Xenopus laevis

摘要

本视频方案演示了一种通过将转基因导入精子细胞核，随后将其移植到未受精卵中，从而生成转基因Xenopus laevis的方法。

摘要

将克隆的基因产物稳定整合到Xenopus基因组中，对于控制基因表达的时间和空间特异性、在胚胎发育的后期阶段表达基因，以及明确增强子和启动子如何在胚胎内调控基因表达至关重要。本文所展示的方案可用于高效地制备转基因Xenopus laevis胚胎。该转基因方法包括三个部分：1. 通过溶血卵磷脂处理成年X. laevis睾丸组织以分离精子细胞核，该处理可使精子质膜通透化。2. 通过低速离心制备卵提取物，加入钙离子以促使提取物进入细胞周期的间期，再经高速离心以分离间期胞质溶胶。3. 核移植：将精子细胞核与卵提取物、线性化的质粒DNA（作为待导入的转基因）以及少量限制性内切酶混合。在短暂的反应过程中，卵提取物部分解凝聚精子染色质，同时限制性内切酶产生染色体断裂，促进转基因与基因组之间的重组。经处理的精子细胞核随后被移植至未受精卵中。转基因的整合通常发生在第一次胚胎卵裂之前，因此获得的胚胎不具嵌合性。这些胚胎无需繁殖至下一代即可进行分析，从而实现对启动子和基因功能研究所需的转基因胚胎的高效快速生成。通过该程序获得的成年X. laevis个体亦可通过生殖系传递转基因，可用于建立多种用途的转基因动物品系。

方案

该转基因方法的改良版本最初在¹和²中被描述。

A. 精子细胞核制备

该细胞核制备方法改编自Murray³，但已省略蛋白酶抑制剂，因为它们会干扰后续精子细胞核移植卵子的发育。分装后于-80°C冷冻保存，可适用于移植实验约6个月。

所有溶液均应在开始制备前配制并置于冰上。

1. 将1-2只成年雄性X. laevis浸入三卡因（Tricaine）溶液中至少20分钟以进行麻醉，随后进行毁髓处理；取出睾丸。
2. 将睾丸在纸巾上轻轻滚动，去除血液、血管和脂肪组织，并在含有1×MMR的60 mm培养皿中短暂清洗，清除残留的脂肪组织。注意避免刺破睾丸，以免释放精子。
3. 将睾丸转移至干燥的60 mm培养皿中，用镊子充分研磨，直至无可见组织块。应尽可能彻底地进行研磨，以获得高产量的细胞核。
4. 向研磨物中加入2 mL冰冷的细胞核制备缓冲液（NPB；由储存液稀释至1×），并用移液器轻轻吹打混匀。
5. 将研磨物通过覆盖在漏斗上的四层纱布过滤，收集滤液至15 mL离心管（例如Falcon 2059）中；用8 mL NPB冲洗培养皿，并将冲洗液同样通过纱布过滤收集至同一离心管中。戴....

讨论

对于每个待检测的转基因构建体，我们通常将细胞核移植到500-1000个卵中；在此规模下，每天可生成表达多达10种不同构建体的转基因胚胎，具体数量取决于诱导产卵的雌性个体数量。在这些移植操作中，约三分之一的卵能够进行卵裂，其中60-80%的卵裂胚胎能正常通过原肠胚形成阶段。根据所用反应条件的不同，这些胚胎中有10-50%会表达目标转基因。因此，一旦该实验流程在实验室中建立，单名操作人员即可在一天内生成表达多种不同质粒的转基因胚胎群体。转基因以串联多聚体形式（5-35个拷贝）整合到基因组中，因此该方法也可用于在单个胚胎中以较高频率（80-90%）将多个不同的转基因共整合到基因组中⁴。

本文所述的转基因方法已成功用于目的基因的异常表达、基因调控研究，以及生成在特定细胞或结构中表达标记物/荧光报告基因的胚胎（例如^4-7）。转基因已可通过生殖系遗传⁸。最后，尽管本实验流程以Xenopus laevis为例进行演示，但也已适用于相关的二倍体物种Xenopus tropicalis⁹。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A. 精子细胞核制备
试剂：
1X MMR（2 mM CaCl₂）2，5 mM HEPES，pH 7.5，2 mM KCl，1 mM MgCl₂2，100 mM NaCl） 0.1% 三卡因甲磺酸盐（MS222，氨基苯甲酸乙酯，Sigma A-5040），0.1% 碳酸氢钠。溶于水中。 2倍核准备黄油液（2X NPB）。在制备精子核的当天，从冷冻保存的储备液中配制30 ml 2X NPB：500 mM 蔗糖（1.5 M 储备液），30 mM HEPES（1 M 储备液；用KOH调节至pH 7.7时浓度为15 mM），1 mM 亚精胺三盐酸盐（Sigma S-2501；10 mM 储备液），0.4 mM 精胺四盐酸盐（Sigma S-1141；10 mM 储备液），2 mM 二硫苏糖醇（Sigma D-0632；100 mM 储备液），2 mM EDTA（500 mM EDTA，pH 8.0）。 使用2XNPB配制：a. 30 ml 1X NPB，b. 10 ml 1X NPB + 3% BSA（Fraction V，Sigma A-7906），c. 5 ml 1X NPB + 0.3% BSA。 溶血卵磷脂：100 μ10 mg/ml L-α-溶血卵磷脂，蛋黄来源（Calbiochem，440154）；使用前室温溶解。固体储备物储存于 20 °C. 若储存粉末变黏，则应弃用。 牛血清白蛋白（BSA）：10%（w/v）BSA（第五组分，Sigma A-7906）。在制备精子核当天，用5 ml水配制。 精子保存缓冲液（1 ml）：1X NPB，30% 甘油，0.3% BSA。 精子稀释缓冲液：250 mM 蔗糖，75 mM KCl，0.5 mM 亚精胺三盐酸盐，0.2 mM 精胺四盐酸盐。调至 pH 7.3–7.5，分装为 0.5–1 ml 份量，于 –20 °C 保存。 °C. H–chst No. 33342 (Sigma B-2261)：10 mg/ml 储存液，溶于dH₂O2O，置于避光容器中，于20℃保存 °C.
设备：
摆动桶转子和离心机 纱布 解剖工具（镊子和剪刀） 荧光显微镜 漏斗 手套 血细胞计数板 针头（26 号） 纸巾 培养皿（60 mm） 移液管 塑料（5 和 10 ml） Pipetman吸头（1 ml和200 μl）μl) 注射器（1 ml） 14 ml 离心管（Falcon，2059） 管 微型离心机（1.5 ml）
B. 高速提取物的制备
试剂：
1X 马克氏改良林格液（MMR）：100 mM NaCl，2 mM KCl，1 mM MgCl₂2，2 mM CaCl₂2，5 mM HEPES，pH 7.5。配制10X储存液，并用NaOH调节pH至7.5。 20X 提取缓冲液（XB）盐母液：2 M KCl，20 mM MgCl₂2，2 mM CaCl₂2，经滤膜除菌后，4℃保存 °C. 提取缓冲液（XB；新鲜配制并置于冰上）：1× XB 盐溶液、50 mM 蔗糖、10 mM HEPES（1 M 储存液，用 KOH 调节至稀释到 15 mM 时 pH 为 7.7；过滤除菌后分装，于 -20 °C 保存） °C). 准备约 100 ml。 2% (w/v) 盐酸L-半胱氨酸一水合物：使用前用1X XB盐溶液配制，并用NaOH调节至pH 7.8。准备约300 ml。 CSF-XB：1X XB 盐，1 mM MgCl2 （除 MgCl₂ 外）2 存在于 XB 盐溶液中；终浓度 2 mM），10 mM HEPES，pH 7.7，50 mM 蔗糖，5 mM EGTA，pH 7.7。配制 50 ml。 蛋白酶抑制剂：亮抑蛋白酶肽（leupeptin）、抑肽酶（chymostatin）和抑胃酶肽（pepstatin）的混合物，每种成分用二甲基亚砜（DMSO）溶解至终浓度为10 mg/ml。分装成小份，于-20℃保存。 °C. 1 M CaCl2. 能量混合液：150 mM 磷酸肌酸，20 mM ATP，20 mM MgCl2. 孕马血清促性腺激素（PMSG）：100 U/ml PMSG（P.G.600）®，Intervet公司，021825）。溶于水，于20℃保存 °C. 人绒毛膜促性腺激素（HCG）：1000 U/ml HCG（CHORULON）®，Intervet, Inc.，057176）。溶于水，4℃保存 °C.
设备：
非洲爪蟾 雌性个体 针头（18 和 26 号） 巴斯德吸管 宽孔径 注射器（1 mL） 微量离心管（0.5 mL） 厚壁聚碳酸酯管（Beckman，349622） 超清晰离心管（14 × 95 mm；Beckman，344060） 超速离心机及转子（例如 Beckman TL-100 配备 SW 40 Ti 和 TLA-100.3 转子） 用于收集卵子的烧杯 用于盛放雌性青蛙的桶或容器（例如，4-L 带网盖塑料烧杯）。
C. 核移植。
试剂：
0.1X MMR 中的 2.5% 琼脂糖（用于制备注射培养皿） 1XMMR 中含 2.5% 半胱氨酸，pH 8.0，现配现用 Ficoll 10 mg/ml 庆大霉素（1000倍浓缩液） 高速卵提取物（见上文） 100 MgCl2 10X MMR（见上文） 限制性内切酶（例如来自 New England Biolabs 的 NotI） 精子稀释缓冲液（SDB；见上文）和精子核（见上文） 人绒毛膜促性腺激素（HCG）如上所述 矿物油（Sigma，M8410） 作为转基因引入的线性化质粒：制备浓度约为 100 ng/μL 的线性化质粒μl 在无菌、无核酸酶的水中（我们避免使用含Tris和EDTA的缓冲液，因为它们对胚胎具有一定的毒性）。用于线性化质粒的限制性内切酶–所用的限制性内切酶不必与核移植反应中使用的相同。我们通常在所有反应中使用NotI，而无论线性化质粒时使用的是哪种酶。反应中所用酶的稀释度可能需要进行一些优化，因为酶用量过多可能对原肠胚形成后的发育产生不利影响。质粒可通过多种方法纯化：我们通常按照生产商的说明使用Qiagen Qiaquick PCR纯化试剂盒；无需从凝胶中回收单一条带。如果采用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法纯化质粒，务必彻底去除所有有机溶剂和乙醇残留。
设备：
用于注射的琼脂糖培养皿：在60 mm塑料培养皿中，将一个35 mm × 35 mm的小称量舟置于熔融的2.5%琼脂糖（溶于0.1×MMR水溶液）上，形成底部带有琼脂糖涂层的凹陷，用于盛放卵子。琼脂糖凝固后，用封口膜包裹，并于4 ℃保存。 °使用前置于冰上。每进行一次转基因反应，需预先制备2-3个培养皿。
输注泵：我们使用哈佛仪器公司（Harvard Apparatus）的单筒注射泵，配备装有矿物油（Sigma M-8410）的3 cc注射器/针头。将注射器针头尖端弄钝（以防止刺穿管路），并连接细型Tygon管路。泵的流速设为约10 nl/sec；此流速假设针头在每个卵内的停留时间不超过1秒。在当天开始转基因操作前，应提前运行泵数分钟，以确保注射器推杆与活塞完全贴合，并且管路末端有稳定持续的正向油流。
核移植用针的制备。使用显微拉针仪制备具有长斜尖端的针。在配有目镜测微尺的解剖显微镜下，用镊子剪切针尖，获得直径约80微米、呈斜面形状的开口。
其他设备： Xenopus laevis 雌性成体、体视显微镜、培养箱、显微操作仪、微注射针拉制仪（例如 Model P-87，Sutter）、注射器针头（26 号）、玻璃微注射针、目镜测微尺，用于校准剪切微注射针尖至 80μ直径为 m 的培养皿、35 mm 称量舟、Tygon 软管（内径 = 1/32 英寸，外径 = 3/32 英寸）