本视频方案演示了一种通过将转基因导入精子细胞核,随后将其移植到未受精卵中,从而生成转基因Xenopus laevis的方法。
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本视频方案演示了一种通过将转基因导入精子细胞核,随后将其移植到未受精卵中,从而生成转基因Xenopus laevis的方法。
将克隆的基因产物稳定整合到Xenopus基因组中,对于控制基因表达的时间和空间特异性、在胚胎发育的后期阶段表达基因,以及明确增强子和启动子如何在胚胎内调控基因表达至关重要。本文所展示的方案可用于高效地制备转基因Xenopus laevis胚胎。该转基因方法包括三个部分:1. 通过溶血卵磷脂处理成年X. laevis睾丸组织以分离精子细胞核,该处理可使精子质膜通透化。2. 通过低速离心制备卵提取物,加入钙离子以促使提取物进入细胞周期的间期,再经高速离心以分离间期胞质溶胶。3. 核移植:将精子细胞核与卵提取物、线性化的质粒DNA(作为待导入的转基因)以及少量限制性内切酶混合。在短暂的反应过程中,卵提取物部分解凝聚精子染色质,同时限制性内切酶产生染色体断裂,促进转基因与基因组之间的重组。经处理的精子细胞核随后被移植至未受精卵中。转基因的整合通常发生在第一次胚胎卵裂之前,因此获得的胚胎不具嵌合性。这些胚胎无需繁殖至下一代即可进行分析,从而实现对启动子和基因功能研究所需的转基因胚胎的高效快速生成。通过该程序获得的成年X. laevis个体亦可通过生殖系传递转基因,可用于建立多种用途的转基因动物品系。
该转基因方法的改良版本最初在1和2中被描述。
A. 精子细胞核制备
该细胞核制备方法改编自Murray3,但已省略蛋白酶抑制剂,因为它们会干扰后续精子细胞核移植卵子的发育。分装后于-80°C冷冻保存,可适用于移植实验约6个月。
所有溶液均应在开始制备前配制并置于冰上。
B. 高速提取物的制备
该方法改编自Murray3,可制备一种间期胞质提取物,能够促进加入的精子细胞核发生肿胀及部分染色质去凝集。提取物可分装成小份,于-80°C冷冻保存,使用前解冻即可。
C. 转基因反应与核移植
重要提示:开始反应前,请确保溶液、设备和青蛙均已准备就绪。一旦开始,必须按照下述大致时间表进行反应,因为许多组分无法长时间保持稳定 >30分钟。在将精子核储备液置于冰上保存的同时,转基因反应体系(包括稀释和浓缩的反应液)应置于室温下保存。
注射后,将培养皿置于16-20°C环境中,直至胚胎发育至4-8细胞期。使用玻璃巴斯德吸管(其管尖直径与卵子相近)将正在卵裂的胚胎与其未卵裂的邻近胚胎分离,转移至含0.2XMMR加4%Ficoll的新大培养皿中。将卵裂的胚胎分入较小的组(每6孔板每孔10-15个胚胎),在含100μg/mL庆大霉素的0.2XMMR(不含Ficoll)培养基中继续培养至早期发育阶段。在原肠胚形成期间应检查胚胎,及时移除死亡胚胎,并根据需要更换培养基。
故障排除:
代表性转基因胚胎结果

通过核移植获得的转基因胚胎应培养至目标启动子的表达可见为止。在上方的图1中,肌动蛋白启动子驱动绿色荧光蛋白在该转基因蝌蚪的体节中表达。
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对于每个待检测的转基因构建体,我们通常将细胞核移植到500-1000个卵中;在此规模下,每天可生成表达多达10种不同构建体的转基因胚胎,具体数量取决于诱导产卵的雌性个体数量。在这些移植操作中,约三分之一的卵能够进行卵裂,其中60-80%的卵裂胚胎能正常通过原肠胚形成阶段。根据所用反应条件的不同,这些胚胎中有10-50%会表达目标转基因。因此,一旦该实验流程在实验室中建立,单名操作人员即可在一天内生成表达多种不同质粒的转基因胚胎群体。转基因以串联多聚体形式(5-35个拷贝)整合到基因组中,因此该方法也可用于在单个胚胎中以较高频率(80-90%)将多个不同的转基因共整合到基因组中4。
本文所述的转基因方法已成功用于目的基因的异常表达、基因调控研究,以及生成在特定细胞或结构中表达标记物/荧光报告基因的胚胎(例如4-7)。转基因已可通过生殖系遗传8。最后,尽管本实验流程以Xenopus laevis为例进行演示,但也已适用于相关的二倍体物种Xenopus tropicalis9。
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动物实验均依照华盛顿大学医学院动物护理与使用委员会制定的指南和规定进行。
我们的研究工作由美国国立卫生研究院(NIH)、美国出生缺陷基金会(March of Dimes)和美国癌症协会提供资助。
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A. 精子细胞核制备 | |||
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B. 高速提取物的制备 | |||
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C. 核移植。 | |||
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设备: | |||
用于注射的琼脂糖培养皿:在60 mm塑料培养皿中,将一个35 mm × 35 mm的小称量舟置于熔融的2.5%琼脂糖(溶于0.1×MMR水溶液)上,形成底部带有琼脂糖涂层的凹陷,用于盛放卵子。琼脂糖凝固后,用封口膜包裹,并于4 ℃保存。 °使用前置于冰上。每进行一次转基因反应,需预先制备2-3个培养皿。 | |||
输注泵:我们使用哈佛仪器公司(Harvard Apparatus)的单筒注射泵,配备装有矿物油(Sigma M-8410)的3 cc注射器/针头。将注射器针头尖端弄钝(以防止刺穿管路),并连接细型Tygon管路。泵的流速设为约10 nl/sec;此流速假设针头在每个卵内的停留时间不超过1秒。在当天开始转基因操作前,应提前运行泵数分钟,以确保注射器推杆与活塞完全贴合,并且管路末端有稳定持续的正向油流。 | |||
核移植用针的制备。使用显微拉针仪制备具有长斜尖端的针。在配有目镜测微尺的解剖显微镜下,用镊子剪切针尖,获得直径约80微米、呈斜面形状的开口。 | |||
其他设备: Xenopus laevis 雌性成体、体视显微镜、培养箱、显微操作仪、微注射针拉制仪(例如 Model P-87,Sutter)、注射器针头(26 号)、玻璃微注射针、目镜测微尺,用于校准剪切微注射针尖至 80μ直径为 m 的培养皿、35 mm 称量舟、Tygon 软管(内径 = 1/32 英寸,外径 = 3/32 英寸) |
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