安装成体果蝇大脑:一种为共聚焦成像准备载玻片的方法

该协议摘自 Kelly 等人，成年黑腹果蝇大脑中蘑菇体和感光神经元的解剖和免疫荧光染色，J. Vis. Exp. （2017）。

1. 将成年黑腹果蝇的大脑安装到显微镜载玻片上并成像

1. 构建 "bridge" 幻灯片。将两个"基础"盖玻片相距约 1 cm 放在带正电的载玻片上。确保载玻片带正电的一面朝上。用指甲油将盖玻片粘附在载玻片上，如 图 1A.通常有助于用指甲油密封每个基盖衬片的三个外边缘，以确保封固剂不会在这些衬套下芯吸。让指甲油完全干燥（10 - 15 分钟），然后再继续。
2. 将载玻片放在立体显微镜下，并将含有解剖大脑的安装介质溶液移液到两个盖玻片之间的空间中。为了提供更高的对比度，纵鹅颈灯使其与工作台平行是有用的。
3. 使用移液管从载玻片上去除额外的安装介质，小心不要将大脑从载玻片上移出。
4. 吸走多余的封固介质。这将使大脑在下一步中能够更精确地定位。
5. 使用一对镊子和立体显微镜，将大脑以网格状放置在载玻片上，触角叶朝上。
6. 在大脑上放置一个盖玻片（"桥"）（图 1A）。使用指甲油密封桥盖衬套的侧面，使其与"底座"盖衬套接触。
7. 使用 p200 移液器，用新的封固剂缓慢填充桥下的中心腔（图 1B）。一次将一滴滴放在中心盖玻片的开口边缘，让封固介质在中心桥盖玻片下芯吸。继续直到整个腔体充满封固剂，然后用透明指甲油密封顶部和底部。
8. 指甲油干燥后，立即对载玻片成像或存放在 -20 °C 的避光密载玻片盒中。
9. 在一周内，使用激光扫描共聚焦显微镜对大脑进行成像，该显微镜带有适合所选荧光二抗的激发激光和滤光片立方体。蘑菇体神经元的 Z 堆栈图像通常使用 20X 或 40X 物镜获得。视网膜感光神经元的成像可能需要更高的放大倍数。

图 1:为免疫荧光成像做准备的大脑。（A） 将大脑安装在带有桥盖的 SuperFrost Plus 载玻片上，以防止大脑变平。将两个"基础"盖玻片粘附在带有透明指甲油的带正电荷的载玻片上，然后将解剖的大脑放在它们之间的载玻片上。将透明的"桥"盖玻片放置在大脑上方并粘附在基盖玻片上。（B） 指甲油干燥后，将 Vectashield 缓慢移液到鼻桥下，以保留二抗的荧光。然后使用透明指甲油密封 "桥 "盖玻片的顶部和底部。请点击这里查看此图的较大版本。