成年样本的制备 果蝇 大脑：用于共聚焦成像的切片制备方法

摘要

来源：Kelly, S. M. 等人 成年果蝇蘑菇体与光感受器神经元的解剖及免疫荧光染色 黑腹果蝇 大脑. J. Vis. Exp. (2017).

本视频介绍了一种将成年果蝇完整大脑在桥式盖玻片下进行封片的方法，并展示了对免疫荧光染色的大脑样本执行该操作的实验流程。

方案

本方案节选自 Kelly 等成年果蝇蘑菇体与光感受器神经元的解剖与免疫荧光染色 黑腹果蝇 大脑 视频实验杂志 (2017).

1. 将成年黑腹果蝇（D. melanogaster）大脑固定于显微镜载玻片上并进行成像

1. 构建一个"桥式"载片。将两个"基底"盖玻片放置在带正电荷的载玻片上，两者相距约1 cm。确保载玻片的带正电荷面朝上。用指甲油将盖玻片固定在载玻片上，如图1A所示。通常建议用指甲油密封每个基底盖玻片的三个外侧边缘，以防止封片剂渗入基底盖玻片下方。继续操作前，需让指甲油完全干燥（10–15分钟）。
2. 将载片置于体视显微镜下，用移液器将含有解剖后脑组织的封片剂溶液滴加至两个盖玻片之间的空隙中。为获得更好的对比度，可调节鹅颈灯位置，使其与实验台面平行。
3. 使用移液器去除载片上多余的封片剂，注意避免将脑组织吸走。
4. 用滤纸吸除多余的封片剂，以便在下一步中更精确地定位脑组织。
5. 在体视显微镜下使用镊子将脑组织以网格状排列置于载片上，确保嗅觉叶朝上。
6. 将一个盖玻片（即"桥式"盖玻片）覆盖在脑组织上方（图1A）。使用指甲油密封桥式盖玻片与"基底"盖玻片接触的两侧。
7. 使用P200移液器，缓慢向桥式结构下方的中央空腔内加入新鲜封片剂（图1B）。每次在中央盖玻片的开口边缘滴加一滴，使封片剂通过毛细作用渗入桥式盖玻片下方。持续操作直至整个空腔被封片剂充满，然后用透明指甲油密封顶部和底部开口。
8. 待指甲油完全干燥后，立即进行成像，或置于避光密闭的载片盒中于-20 °C保存。
9. 在一周内，使用激光扫描共聚焦显微镜对脑组织进行成像，选择与所用荧光二抗相匹配的激发激光和滤光片组。蘑菇体神经元的Z轴层扫图像通常采用20X或40X物镜获取；视网膜感光神经元的成像可能需要更高倍数的放大。

结果

图1：脑组织切片的封片准备，用于免疫荧光成像。 （A）将脑组织置于SuperFrost Plus载玻片上，并使用“桥接”盖玻片防止脑组织压扁。首先用透明指甲油将两片“基底”盖玻片固定在带正电荷的SuperFrost Plus载玻片上，然后将解剖好的脑组织置于两者之间。再将一片透明的“桥接”盖玻片置于脑组织上方，并粘附在两侧的基底盖玻片上。（B）待指甲油完全干燥后，缓慢将Vectashield从桥接盖玻片下方注入，以保护二抗的荧光信号。随后用透明指甲油密封“桥接”盖玻片的顶部和底部边缘。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微解剖镊子	Ted Pella	505-NM
抗荧光淬灭封片剂（VectaShield）	Vector Labs	H-1000
SuperFrost Plus 载玻片	ThermoFisher	99-910-01
盖玻片	ThermoFisher	12-553-454
指甲油	Electron Microscope Services (EMS)	72180
体视显微镜	Leica S6D 配 KL300 LED 光源
吸水纸（Kimwipe）	Fisher	06-666