线虫冻裂法：一种暴露线虫内部组织以进行染色的方法

摘要

来源：Zhang, N., 等. 以秀丽隐杆线虫肠道为模型研究细胞间管腔形态发生及单细胞水平体内极化膜生物合成：抗体染色、RNAi功能缺失分析与成像. J. Vis. Exp. (2017)。

本视频介绍了冻裂法，这是一种通过破坏秀丽隐杆线虫（C. elegans）的角质层，使其组织能够进行抗体染色的方法。

方案

本方案节选自 Zhang 等，The 秀丽隐杆线虫 肠道作为细胞间管腔形态发生的模型 在体 内 单细胞水平下的极化膜生物发生：抗体染色标记、RNAi 功能缺失分析与成像 J. Vis. Exp. (2017).

抗体染色 秀丽隐杆线虫 肠道

1. 固定
   1. 取一张洁净的载玻片，用聚-L-赖氨酸形成一层薄膜，以便线虫附着。加入30 µL 0.1–0.2% 聚-L-赖氨酸 在载玻片上放置一滴多聚赖氨酸，并将另一张载玻片覆盖在多聚赖氨酸液滴上以形成 "三明治"然后轻轻摩擦载玻片数次，以润湿两者的整个表面，并使其在空气中干燥30分钟。用铅笔在载玻片的磨砂面上进行标记。
      注意： 将聚-L-赖氨酸粉末溶于dH₂O中，配制200 µL的0.2%聚-L-赖氨酸等分试样₂O；可在 -20 °C 保存。使用高分子量的聚-L-赖氨酸以增强线虫的附着效果。聚-L-赖氨酸的浓度也至关重要：浓度过低会导致线虫无法附着，而浓度过高可能产生荧光背景信号。涂布过厚的薄膜可能整体脱落。
   2. 将一块平整的金属块牢固地放置在容器底部（例如 装有液氮的聚苯乙烯容器。
      注意： 可以使用干冰替代，但液氮能使金属块在容器底部保持更稳定，并具有良好的冷却效果。
   3. 用液体冲洗培养板收集线虫 M9 或挑选不同发育阶段的线虫（包括卵、L1、L2、L3 或 L4 幼虫）分别置于载玻片上。通常每张载玻片放置约 100 个幼虫和胚胎，或约 20 只成虫。将 10 µL 洗涤后的线虫置于载玻片中央，或将卵/线虫挑入 10 µL M9 溶液或 10 µL 1x PBS （磷酸盐缓冲液）
      1. 使用移液器分散大量线虫，以避免聚集。
         注意：由于拥挤和不同发育阶段的厚度差异，洗脱下来的混合虫群附着效果较差，且冻裂效率较低（见下文），因此挑选特定发育阶段的线虫（或同步化群体）可获得更优结果。幼虫比成虫更易附着，且每张载玻片可放置更多个体。
      2. 在将线虫挑取到载玻片之前，先将其转移至一个 线虫生长培养基（NGM）平板 无OP50细菌。附着在蠕虫上的过量细菌也可能干扰粘附。注意防止蠕虫干燥。
   4. 将一块 22 mm × 22 mm 的盖玻片交叉放置在收集的线虫样本上，使其边缘至少在一侧悬出载玻片。用一或两个手指轻轻但稳固地垂直向下按压盖玻片，避免产生剪切力而破坏组织完整性。
   5. 立即轻柔地将载玻片转移至液氮中的金属块上，静置约5分钟以充分冷冻。然后 "轻弹掉" 利用悬垂边缘，迅速地移动盖玻片。
      注意： 此步骤必须在载玻片处于冷冻状态时果断完成，以达到 "破裂" 角质层。注意：使用液氮时，请遵循个人防护装备（PPE）的使用指南。
   6. 将冻裂的载玻片浸入 甲醇-20 °C 下在玻璃 Coplin 染色缸中孵育 5 分钟。然后转移至 丙酮-20 °C 下在装满玻璃的 Coplin 染色缸中继续孵育 5 分钟。
      注意： 甲醇和丙酮应在使用前于 -20 °C 下保存至少 30 分钟。固定后，载玻片可于 -20 °C 保存。
      警告： 甲醇和丙酮有毒。
   7. 从玻璃罐中取出载玻片，室温下自然晾干后使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体染色
聚-L-赖氨酸	Sigma	P5899
甲醇	Fisher Scientific	A452-4
丙酮	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount 中性树胶	Fisher Scientific	SP15-100
显微镜载玻片	Fisher Scientific	4448
显微镜盖玻片 (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 培养基			实验室自制
OP50 菌株	CGC