$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
本方案节选自 Zhang 等，The 秀丽隐杆线虫 肠道作为细胞间管腔形态发生的模型 在体 内 单细胞水平下的极化膜生物发生：抗体染色标记、RNAi 功能缺失分析与成像 J. Vis. Exp. (2017).
抗体染色 秀丽隐杆线虫 肠道
- 固定
- 取一张洁净的载玻片，用聚-L-赖氨酸形成一层薄膜，以便线虫附着。加入30 µL 0.1–0.2% 聚-L-赖氨酸 在载玻片上放置一滴多聚赖氨酸，并将另一张载玻片覆盖在多聚赖氨酸液滴上以形成 "三明治"然后轻轻摩擦载玻片数次，以润湿两者的整个表面，并使其在空气中干燥30分钟。用铅笔在载玻片的磨砂面上进行标记。
注意： 将聚-L-赖氨酸粉末溶于dH₂O中，配制200 µL的0.2%聚-L-赖氨酸等分试样2O；可在 -20 °C 保存。使用高分子量的聚-L-赖氨酸以增强线虫的附着效果。聚-L-赖氨酸的浓度也至关重要：浓度过低会导致线虫无法附着，而浓度过高可能产生荧光背景信号。涂布过厚的薄膜可能整体脱落。
- 将一块平整的金属块牢固地放置在容器底部（例如 装有液氮的聚苯乙烯容器。
注意： 可以使用干冰替代，但液氮能使金属块在容器底部保持更稳定，并具有良好的冷却效果。
- 用液体冲洗培养板收集线虫 M9 或挑选不同发育阶段的线虫（包括卵、L1、L2、L3 或 L4 幼虫）分别置于载玻片上。通常每张载玻片放置约 100 个幼虫和胚胎，或约 20 只成虫。将 10 µL 洗涤后的线虫置于载玻片中央，或将卵/线虫挑入 10 µL M9 溶液或 10 µL 1x PBS （磷酸盐缓冲液）
- 使用移液器分散大量线虫，以避免聚集。
注意：由于拥挤和不同发育阶段的厚度差异，洗脱下来的混合虫群附着效果较差，且冻裂效率较低（见下文），因此挑选特定发育阶段的线虫（或同步化群体）可获得更优结果。幼虫比成虫更易附着，且每张载玻片可放置更多个体。
- 在将线虫挑取到载玻片之前，先将其转移至一个 线虫生长培养基（NGM）平板 无OP50细菌。附着在蠕虫上的过量细菌也可能干扰粘附。注意防止蠕虫干燥。
- 将一块 22 mm × 22 mm 的盖玻片交叉放置在收集的线虫样本上，使其边缘至少在一侧悬出载玻片。用一或两个手指轻轻但稳固地垂直向下按压盖玻片，避免产生剪切力而破坏组织完整性。
- 立即轻柔地将载玻片转移至液氮中的金属块上，静置约5分钟以充分冷冻。然后 "轻弹掉" 利用悬垂边缘，迅速地移动盖玻片。
注意： 此步骤必须在载玻片处于冷冻状态时果断完成，以达到 "破裂" 角质层。注意：使用液氮时，请遵循个人防护装备（PPE）的使用指南。
- 将冻裂的载玻片浸入 甲醇-20 °C 下在玻璃 Coplin 染色缸中孵育 5 分钟。然后转移至 丙酮-20 °C 下在装满玻璃的 Coplin 染色缸中继续孵育 5 分钟。
注意： 甲醇和丙酮应在使用前于 -20 °C 下保存至少 30 分钟。固定后，载玻片可于 -20 °C 保存。
警告： 甲醇和丙酮有毒。
- 从玻璃罐中取出载玻片，室温下自然晾干后使用。