成年果蝇中肠解剖：一种消化道分离方法

摘要

来源：Tauc, H. M. 等人。通过FACS从成年Drosophila中肠分离肠道干细胞以研究衰老过程中的干细胞行为。J. Vis. Exp. (2014)。

在本视频中，我们展示了成年Drosophila肠道的解剖过程，以及中肠的收集方法，适用于单细胞分离和流式细胞分选（FACS），以分离肠道干细胞。

方案

本方案节选自 陶克 等., 分离成年小鼠肠道干细胞 果蝇 通过FACS分离中肠以研究衰老过程中的干细胞行为， 视觉实验杂志. (2014).

注意：如果首次使用本方案通过 FAC 分选来分离 ISCs，则必须设置以下对照，以便正确初始化 FACS 参数：来自野生型（例如 w¹¹¹⁸）Drosophila 中肠的解离细胞，不加 Sytox；来自野生型（例如 w¹¹¹⁸）Drosophila 中肠的解离细胞，加 Sytox（见步骤 3.6）；来自esg-Gal4、UAS-GFP 果蝇品系中肠的解离细胞，不加 Sytox。

1. 肠道解剖用溶液和培养皿的准备

1. 准备4-6个样品管，每个样品管中放入40只来自esg-Gal4, UAS-GFP果蝇品系的雌性果蝇。
2. 用10倍浓度的PBS储存液配制500 ml的1倍浓度PBS（含1.8 mM NaH₂PO₄·H₂O、8.4 mM Na₂HPO₄·2H₂O、175 mM NaCl，调节pH至7.4）。
3. 在1×PBS中配制3.5%的琼脂糖溶液（3.5 g电泳级琼脂糖溶于100 ml 1×PBS）。将该溶液倒入培养皿（直径8.5 cm）中，覆盖底部，制成解剖板。琼脂糖层可防止解剖过程中损坏镊子尖端。凝胶凝固后，将解剖板置于4 °C保存。
4. 在解剖前新鲜配制300 ml含1% BSA的1×PBS，并将瓶子置于冰上或4 °C环境中。
5. 开启离心机，并使其预冷至4 °C。
6. 用火焰灼烧两根玻璃巴斯德吸管的管口，以使边缘光滑。
7. 用70%乙醇清洁两对镊子和一把剃刀刀片。
8. 将4至6个1.5 ml微量离心管放在冰上，用于收集解剖得到的中肠组织。

2. 胃肠道的准备与中肠的解剖

1. 将一个试剂瓶中的果蝇（40只）用CO₂在标准果蝇操作台麻醉，用刀片切除所有果蝇的头部，并将其转移至解剖皿中。向解剖皿中加入冰冷的1× PBS/1% BSA溶液，直至覆盖琼脂糖凝胶。果蝇将漂浮于液面上。
2. 用一对镊子夹住果蝇腹部，同时用另一对镊子固定胸部。将胸部与腹部分离。此时消化道可见，前肠/嗉囊很可能仍与胸部相连。
3. 用镊子夹住消化道，将其从胸部拉出。为展开肠道，夹住嗉囊并轻轻将肠道向前（朝向头部方向）拉离腹部。
4. 用一对镊子夹住腹部后端，另一对镊子夹住前端切开的体壁边缘。注意不要损伤外露的肠道组织。将后端向外拉开以撕裂体壁，并非常轻柔地继续向后拉，直至整个肠道完全从腹腔中拉出。若嗉囊过大无法通过体腔，需预先将其去除。
5. 去除前肠、马氏管、后肠及卵巢，仅保留中肠。
6. 使用玻璃巴斯德吸管，将一批已解剖的中肠转移至含有冰冷1× PBS/1% BSA溶液的1.5 ml微量离心管中，并将离心管置于冰上。样品必须在2小时内完成后续处理。
7. 完成一批果蝇的解剖后，用双蒸水冲洗解剖皿，以清除残留碎片。开始解剖下一批中肠（重复步骤2.1–2.7）。在2小时内尽可能多地完成解剖批次，随后进入步骤3.1。

3. 消化肠道组织以收获用于流式细胞分选的细胞

1. 从中肠样本中移除1x PBS/1% BSA溶液，每份样本加入500 µl的0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液。
2. 充分涡旋振荡20秒，并在室温下以20 rpm轻柔摇动或旋转孵育25–30分钟。
3. 约30分钟后再次涡旋振荡，使完整的中肠组织沉降至管底。用火焰灭菌的玻璃巴斯德吸管小心吸取悬浮的细胞，经35 µm尼龙滤网过滤至新的1.5 ml微量离心管中。
4. 在4 °C下以100 × g离心5分钟，使细胞沉淀。注意：开始消化时，细胞沉淀可能暂时不可见，但随着组织消化的进行会逐渐显现。
   1. 小心将胰蛋白酶溶液重新转移回含有剩余完整中肠组织的原始样本管中。避免转移过多来自沉淀的细胞。
   2. 将细胞沉淀轻柔重悬于400 µl预冷的1x PBS/1% BSA溶液中。将含有解离细胞的微量离心管置于冰上，并用铝箔包裹以避光保护细胞。
   3. 再次涡旋振荡含有剩余完整中肠组织的胰蛋白酶溶液，并将样本置于摇床，在室温下继续孵育30分钟。
5. 重复步骤3.3至3.4.3，直至所有中肠组织完全消化。将所有微量离心管中的解离细胞合并至同一管中。由于所有细胞悬液总体积可能超过1.5 ml，必要时可参照步骤3.4进行一次离心。合并后的细胞悬液应始终置于冰上并避光保存。
6. 在4 °C下以100 × g离心5分钟，使解离的细胞沉淀。小心吸除上清液，尽量去除干净，仅保留约50–100 µl的1x PBS/1% BSA溶液。轻柔地将细胞重悬于800 µl含Sytox（1:20,000）的1x PBS/1% BSA溶液中。
7. 通过细胞筛网帽（35 µm尼龙滤网）将细胞悬液过滤转移至5 ml圆底Falcon管中。始终将细胞样本置于冰上并避光保存。此时细胞已准备好进行分选。
8. 向每支用于后续RNA提取的细胞分选微量离心管中加入600 µl RNAlater溶液。如用于其他下游实验，细胞也可收集于其他溶液中，例如无菌PBS。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
镊子：Dumont，Inox Biologie #5	精细科学工具	11252-20
SefarNitex 03-150um/38（35 µm 尼龙筛网）	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml 圆底聚苯乙烯试管，带细胞过滤器 snap cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A4503-50G
0.5% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	15400-054	不同公司生产的胰蛋白酶活性可能不同 ，因此胰酶消化时间需相应调整。
用于流式细胞术的 SYTOX Blue 死细胞染料	Life Technologies	S34857
RNA later 稳定液	Life Technologies	AM7023	其他溶液（如 Trizol）也可用于后续 RNA 提取
FACSAria II 细胞分选仪	Becton Dickinson		分选前一小时开启仪器