寿命分析：测量 C. elegans 的寿命

摘要

来源：Cornwell, A. B.，等。复制集方法：一种高通量定量测量Caenorhabditis elegans寿命的技术。J. Vis. Exp. （2018）。

本视频介绍了一种传统的基于平板的测量秀丽隐杆线虫（C. elegans）寿命的方法。示例实验方案测量了经RNAi处理的线虫的寿命。

方案

以下方案节选自 Cornwell 等，《复制集方法：一种高通量定量测量秀丽隐杆线虫寿命的技术》，J. Vis. Exp. （2018）。

1. 通过添加5-氟-2'-脱氧尿苷（FUdR）抑制子代产生

1. 将动物在20 °C下培养至L4阶段。在接种后约40小时（步骤2.1.7）检查同步化的动物是否已发育至L4阶段。
   注意：C. elegans 的发育时间会因温度不同而有所变化，对于尚未明确生长速率的突变体动物，其发育速率必须通过实验进行测定。
   1. 向每块含有L4期动物的6 cm培养皿中加入160 µL的50倍浓缩FUdR溶液。
      注意：必须在L4阶段添加FUdR。为方便使用，可配制1000倍浓缩的FUdR储存液：将1 g FUdR溶解于10 mL超纯H₂O中，用0.2 µm滤器和10 cc注射器过滤除菌，将约1 mL储存液分装至无菌的1.5 mL离心管中，于-20 °C冷冻保存。
2. 检查培养皿中是否存在雄性C. elegans，并将所有雄性个体移除。
   注意：寿命测定通常针对雌雄同体个体而非雄性个体。即使存在FUdR，交配过的雌雄同体个体寿命也比未交配个体短。雄性个体比雌雄同体个体更小、更细长，且具有明显的钩状尾部，易于识别。
3. 将盒子重新放回自封袋中，放回20 °C培养箱。

2. 评估存活率

1. 每天用铂丝或睫毛轻轻触碰动物头部，评估其存活情况。若动物无任何移动，则记为死亡，并将其从培养板中移除（图1A）。记录每种条件下每次观察时间点的死亡个体数量。
   注意：为降低评分偏倚的风险，实验操作者必须对实验分组保持盲态，且在评分过程中不得参考先前时间点的结果。
2. 对发生破裂、因其他明显发育缺陷死亡或爬至培养皿壁上的动物进行删失处理：移除这些个体，并在每次观察时间点记录其数量，供后续统计分析时考虑。此外，若发现雄性个体，也应将其移除并记录观察到的数量。
3. 从第2.1步开始每日重复，直至所有动物均死亡。
   注意：若培养板上的 E. coli 菌苔显著减少或出现真菌污染，应将所有剩余动物转移至含有相应RNAi和FUdR的新鲜培养板中。

结果

图1：传统方法与复制集方法用于评估C. elegans寿命（A）。传统方法用于评估 C. elegans 寿命。每种条件下培养多个小型的同基因型同步化种群，并随时间追踪其存活情况。在整个研究过程中持续观察同一动物群体。通过运动能力评估存活状态，必要时可轻柔触碰刺激其活动。无法移动的个体被记为死亡，并予以移除（图中显示为抽吸移除），直至无存活个体剩余。（B）。复制集方法用于评估 C. elegans 寿命。将大量年龄同步化的同基因型动物分配至多个相同的重复平板中。在每个时间点，仅对其中一个重复平板...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氟脱氧尿苷（FuDR，5-氟-2'-脱氧尿苷）	Alfa Aesar	L16497
24孔细胞培养板	Greiner Bio-One	#662102
600 µL 96孔板	Greiner Bio-One	#786261
2 mL 96孔板	Greiner Bio-One	#780286
96针平板复制器	Nunc	250520
以HT115细菌为载体的秀丽隐杆线虫RNAi克隆文库（Ahringer文库）	Source Bioscience	秀丽隐杆线虫RNAi文库（Ahringer）	另见 Kamath 等，Nature 2003。
以HT115细菌为载体的秀丽隐杆线虫RNAi克隆文库（Vidal文库）	Source Bioscience	秀丽隐杆线虫ORF-RNAi资源库（Vidal）	另见 Rual 等，Genome Research 2004。该文库亦可从Dharmacon获取。
L4440 空载体质粒	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/