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酶解与手动解离：一种制备秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎用于细胞培养的方法

2023年4月30日

本文内容

摘要

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来源：Sangaletti, R. 和 Bianchi, L. 一种培养秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎细胞的方法。J. Vis. Exp. (2013)。

本视频介绍了一种分离并无菌培养胚胎的方法 秀丽隐杆线虫 细胞 体外

方案

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1. 胚胎细胞解离

  1. 在超净工作台内进行无菌操作，完成后续步骤。尽管动物体表可能带有细菌，但通过洗涤及含漂白剂的裂解液处理，可去除大部分甚至全部细菌。因此，在本步骤中使用层流罩可防止卵悬浮液被新的微生物污染。
  2. 将沉淀的卵重悬于1 ml含2 mg/ml甲壳质酶的溶液中（溶于pH 6.5卵缓冲液的储存液），转移至新的无菌15 ml锥形离心管中。室温下轻轻摇动10–30分钟。具体孵育时间取决于酶的活性及室温条件，需根据每次实验情况确定。建议在孵育10分钟后，使用倒置细胞培养显微镜观察卵的消化情况。注意：根据我们的经验，较低pH值可提高甲壳质酶的酶活性。因此，我们使用pH 6.5的卵缓冲液溶解甲壳质酶（配方见上文，其中pH值用NaOH调节至6.5）。
  3. 当约80%的卵壳被甲壳质酶消化后（图1 A-B），在900 × g（约2,500 rpm）下离心3分钟，使卵沉淀。使用P1000移液器和无菌吸头小心吸除上清液，并加入3 ml L-15培养基。
  4. 将卵转移至直径6 cm的培养皿中，使用配备18 G针头的10 ml无菌注射器轻轻吹打以解离细胞。取一滴细胞悬液置于新的塑料培养皿中，在显微镜下观察解离程度。操作过程中切勿吸入空气，以免损伤细胞。持续解离直至约80%的细胞呈单细胞状态。
  5. 使用无菌5 μm Millipore滤膜过滤细胞悬液。过滤步骤必不可少，以去除细胞团块、未消化的卵及已孵化的幼虫。再额外过滤4–5 ml新鲜L-15培养基，以回收滤膜上残留的全部细胞。过滤过程中避免施加过大压力，以防损坏滤膜或细胞。

2. 细胞培养

  1. 通过在900 x g（约2,500 rpm）下离心3分钟，使解离的细胞沉淀。使用P1000移液器和无菌吸头小心吸除全部上清液。将沉淀的细胞重悬于完全L-15培养基中，并以1 ml/孔接种。所加培养基的体积取决于使用的8P板数量、板上蠕虫的汇合度以及将在细胞上进行的实验类型。可使用血细胞计数板确定细胞密度。用于膜片钳记录时，接种密度约为230,000个细胞/cm2为最佳。
  2. 将24孔板置于装有湿润纸巾的塑料密封盒中，以防止培养基蒸发。将该容器置于20 °C、空气环境的恒湿培养箱中保存。
  3. 通常在24小时内，当细胞形态分化完成且GFP标记物表达充分后，细胞即可用于实验。细胞可在培养中维持长达2周，但通常在接种后7–9天内状态最佳。为维持细胞健康，需每天更换一次培养基。

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结果

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细胞分裂显微图像；A：单个细胞，B：多个细胞，箭头指示分裂。
图1. C. elegans 胚胎在溶菌酶处理前后的形态。（A）未接触溶菌酶前的卵图像。箭头指向包围胚胎的透明且完整的卵壳。（B）经溶菌酶处理10分钟后，卵壳已被消化，胚胎周围不再可见卵壳结构。箭头指示从卵壳中释放出的三倍体胚胎。蓝色框内为仍相互连接的一组细胞。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<strong>试剂</strong>
Leibovitz's L-15 培养基 (1x) 液体Invitrogen11415-064
胎牛血清Invitrogen16140-063
青霉素-链霉素SigmaP4333-100ML
灰色链霉菌来源的几丁质酶SigmaC6137-25UN
花生凝集素SigmaL0881-10MG
<strong>设备</strong>
101-1000 &mu;l 蓝色刻度移液器吸头USA Scentific1111-2821
10 ml 无菌移液管，独立包装USA Scentific1071-0810
人体工学可调体积移液器（100-1000 &mu;l），带吸头弹出装置VWR International Inc.89079-974
便携式移液辅助器，DrummondVWR International Inc.53498-103
无菌塑料移液管VWR International Inc.14670-114
15 ml 锥形管USA Scentific1475-1611
无菌18号针头Becton, Dickinson and Co.305196
无菌10 ml 注射器Becton, Dickinson and Co.305482
Corning 塑料注射器滤器，孔径 0.20 &mu;mCorning431224
Acrodic 25 mm 注射器滤器，带 5 &mu;m versapor 膜VWR International Inc.28144-095
60x15 mm 无菌培养皿VWR International Inc.82050-548
100x15 mm 无菌培养皿VWR International Inc.82050-912
直径 12 mm 玻璃盖玻片VWR International Inc.48300-560
透明细胞培养板，24 孔，平底，带盖Thomas scientific6902A09
Dumont #5 精细镊子Fine Science Tools11254-20
5702 型离心机Eppendorf22629883
层流罩
倒置显微镜，配备 10 倍物镜
常温恒湿培养箱

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