在本视频文章中，我们介绍了一种利用红外捕获（IR）型激光显微切割技术（LCM）从三龄幼虫中分离单个或多个黑腹果蝇（Drosophila）da神经元的方法。从分离的神经元中获得的RNA可直接用于后续实验，包括定量逆转录PCR（qRT-PCR）或微阵列分析。
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摘要
摘要
果蝇外周神经系统（PNS）中的树突分支（da）神经元为研究特定类型树突形态发生的分子机制提供了一个极佳的模型系统1,2。为了促进对特定类型da神经元发育的分子分析，至关重要的是获得高纯度的此类细胞群体。尽管目前已存在多种针对果蝇细胞的细胞或组织特异性RNA分离技术，包括基于磁珠的细胞纯化3,4、荧光激活细胞分选（FACS）5-8以及基于RNA结合蛋白的策略9，但这些方法均难以实现对单个或多个特定类型的果蝇da神经元进行具有高空间精度的分离。激光显微切割（LCM）作为一种极为强大的工具，已可用于从组织切片中以高空间分辨率和准确性分离特定类型的细胞。从分离得到的细胞中提取的RNA，可进一步用于特定细胞类型的分析，包括qRT-PCR和微阵列表达谱分析10-16。迄今为止，LCM在果蝇组织和细胞分析中的应用仍较为有限17,18，包括对三龄幼虫发育阶段的da神经元的研究。
在此，我们展示了优化的小胶质细胞分离方案 果蝇 使用红外（IR）类激光显微切割技术（LCM）分离da神经元。该方法可高特异性、高空间分辨率地捕获单个、特定类别或多个da神经元。选取表达相应标记物的同龄三龄幼虫进行实验。 UAS-mCD8::GFP19 由IV类da神经元特异性启动子调控的转基因 ppk-GAL420 驱动基因或 pan-da 神经元特异性 21-7-GAL421 驱动基因用于这些实验。从分离的da神经元中获得的RNA质量非常高，可直接用于后续应用，包括qRT-PCR或微阵列分析。此外，该LCM方案可轻松调整以捕获其他 果蝇 不同细胞类型在发育的各个阶段，依赖于细胞类型特异性 GAL4-GFP的驱动表达模式
方案
激光显微切割（LCM）的一般注意事项 果蝇 外周神经元
根据组织类型和所需细胞数量，激光显微切割（LCM）的时间可从6小时到一周甚至更长时间不等。
所有操作均在严格无RNA酶的条件下，按照标准流程进行。本实验使用了表达 21-7-GAL4,UAS-mCD8::GFP 或 ppk-GAL4,UAS-mCD8::GFP 转基因报告基因品系的幼虫。
1. 幼虫的准备
- 收集30-40只年龄相匹配的三龄幼虫，用ddH2O清洗，随后用RNAse Away（Sigma-Aldrich）短暂漂洗，最后再用ddH2O洗涤以去除残留的RNAse Away。在将幼虫包埋于OCT包埋剂之前，用洁净的Kimwipe纸彻底吸去多余的ddH2O。
- 取一个洁净的组织包埋模具，在其中铺上一层薄薄的OCT（厚度1.5-2 mm），足以覆盖单层幼虫即可。
- 在包埋幼虫前，如需要，可将含有OCT的包埋模具置于冰块上，使OCT冷却至0°C。此步骤有助于减少包埋过程中幼虫的移动。
- 将洁净的幼虫放置在预冷的OCT表面，并彼此平行排列。待幼虫排布完成后，缓慢加入OCT填充模具，注意避免扰动幼虫排列。将模具置于干冰上进行速冻。[关键步骤：需立即速冻幼虫，以减少其移动。] 该方法可使幼虫保持在同一平面上，从而最大化每张切片中可捕获的细胞数量。
如果需要保留组织形态以鉴定目的细胞，或发现每张切片中预期的细胞数量已足够，则直接进入第11步。
如果细胞已被特异性标记，并可通过易于识别的标记物（如 GFP 或 RFP）进行鉴定，但每张切片中的细胞数量较少，则步骤 5-10 可有助于增加每张切片可用于捕获的细胞数量。这些为可选步骤，仅在其他方法无法获得理想结果时，作为增加每张切片中可用于激光显微切割的 da 神经元数量的备选方案加以考虑。[注意：该方法可能破坏整体组织形态，导致基于特定空间位置的组织鉴定变得极为困难。]
- 按照步骤1所述方法清洗50-70只三龄幼虫。将幼虫置于含有500 μl无RNA酶的1X PBS的1.5 ml微量离心管中。
- 使用聚丙烯研杵（USA Scientific），以6-7次缓慢而有力的研磨动作进行研磨。
- 将溶液在16,000 (x) g离心5-10秒（直至幼虫表皮沉降至微量离心管底部），弃去上清液。沉淀物主要应为紧密附着外周神经系统（包括da神经元）的幼虫表皮。
- 用1X PBS洗涤表皮沉淀物2-3次，并将沉淀重悬于500 μl 1X PBS中。在16,000 (x) g离心1分钟以形成致密沉淀。使用细口巴斯德吸管完全吸除上清液。
- 使用洁净的刮勺小心地将沉淀从微量离心管中取出，并用洁净的Kimwipe纸巾吸去多余的PBS。[注意：保持沉淀尽可能致密对于提高细胞得率至关重要]。将致密的表皮沉淀置于含有薄层OCT（约1 mm）的塑料模具中。
- 轻柔地将沉淀在模具内均匀铺展成薄层圆形区域。加满OCT包埋剂，并按照步骤4所述方法冷冻组织。
- 使用冷冻切片机在无涂层、有标记、不带电、无RNA酶的玻璃载玻片上切割5-8 μm厚的冷冻切片。[关键步骤：将组织切片置于载玻片中央附近位置。]
- 将载玻片直接保存在干冰上，或置于洁净的载玻片盒中于-80°C保存，直至进行显微切割。建议在切片后一周内完成激光显微切割（LCM）。
暂停点
2. 冷冻幼虫切片的脱水与角质层去除
[关键步骤：每次激光显微切割（LCM）实验前必须新鲜配制所有脱水溶液。冷冻幼虫组织切片的彻底脱水对于实现最佳显微切割效率至关重要]
- 从 -80°C 冰箱中取出含有冷冻幼虫组织切片的载玻片，并将其置于干冰上。
- 从干冰上取下一张载玻片，立即直接放入装有 70% 乙醇固定液的 50 ml 锥形管中，随后根据表 1 所示推荐时间用无 RNA 酶的 ddH2O 进行短暂漂洗。
- 冷冻切片中的幼虫角质层可能会影响捕获效率，因其会阻碍激光显微切割（LCM）帽与细胞之间的有效接触，从而导致非特异性捕获。如有必要，请执行以下步骤（4–5）以去除组织切片中的角质层。
- 用移液器轻轻将 50 μl 的 2.5% 胰蛋白酶直接滴加到组织切片上，在室温下孵育 5–30 秒。[关键步骤：此步骤可能需要优化。孵育时间取决于待显微切割的组织类型及切片厚度。孵育时间过长可能导致包括目标细胞在内的所有成分被清除，而时间过短则可能不足以去除角质层]
- 将载玻片在装有无 RNA 酶 ddH2O 的 50 ml 锥形管中短暂漂洗，以去除胰蛋白酶及松散附着的角质层碎片。
- 按照推荐时间（表 1）依次将载玻片浸入剩余的乙醇和二甲苯溶液中，完成脱水过程。
- 完成梯度脱水后，在进行激光显微切割（LCM）前，将载玻片在室温下用温和气流短暂吹干 60–120 秒。[注意：进行 LCM 前必须将组织切片中的二甲苯完全干燥。已知二甲苯可溶解 LCM 帽的聚合物，导致显微切割失败]
| 70% 乙醇（固定剂） | 3-10 秒 |
| ddH2O | 5-10 秒 |
| 2.5% 胰蛋白酶孵育 | 5-30 秒 |
| ddH2O | 5-10 秒 |
| 70% 乙醇 | 60 秒 |
| 95% 乙醇 | 60 秒 |
| 100% 乙醇 | 120 秒 |
| 100% 乙醇 | 120 秒 |
| 100% 二甲苯 | 120 秒 |
| 100% 二甲苯 | 120 秒 |
| 在温和气流中晾干 | 60-120 秒 |
表1：冷冻幼虫组织切片激光捕获显微切割脱水的推荐步骤。
3. 激光显微切割
使用配备 Fluor 300 落射荧光光学系统（针对 EGFP 优化）的 PixCell IIe LCM 仪器进行激光显微切割操作。
[关键步骤：如有可能，应在湿度可控的环境中进行显微切割，以避免因湿度变化导致显微切割效率下降。环境湿度是影响显微切割效率的关键因素。低湿度环境会增加静电吸附，导致非特异性捕获；而高湿度则会降低显微切割效率。我们在相对湿度为25–50%的条件下获得了最佳的激光显微切割（LCM）效率。]
- 打开显微镜和激光控制箱的电源。
- 将HS LCM帽（Molecular Devices）装入CapSure帽架组件中：每次最多可装载两个LCM帽弹匣。
- 打开Molecular Devices软件，并输入实验信息，包括载玻片编号和帽批次号。
- 从弹匣中将一个新的HS LCM帽装入PixCell IIe LCM仪器，并根据操纵杆正确放置，以确保帽相对于捕获区域的准确定位。
- 将含有新鲜脱水的幼虫组织切片的显微镜载玻片放置在显微镜载物台上，用于显微切割。
- 使用目镜或计算机屏幕定位荧光标记的细胞。由于ppk-GAL4,UAS-mCD8::GFP转基因报告品系具有高度特异性，可通过GFP荧光轻松识别IV类da神经元。
- 使用CapSure HS LCM帽对组织进行激光显微切割[有关设置仪器、聚焦激光和执行LCM的详细操作步骤，请参见参考文献22]。
- 调整“功率”和“持续时间”激光脉冲参数，以获得精确的熔融聚合物斑点，其大小与所选激光斑点直径相对应。调节设置以自定义熔融聚合物区域的大小。以下参数用于单个IV类da神经元的显微切割：斑点直径7.5 μm，激光强度30–50 mW，激光时间2–4 ms，每个细胞1–2次脉冲。[关键步骤：获得合适斑点所需的激光参数可能因组织厚度和室内湿度条件而异。应调整“功率”和“持续时间”设置，以达到显微切割单个或多个细胞所需的熔融聚合物斑点大小。]
- 为最大限度提高特异性，应选择荧光强且重叠最少的细胞进行显微切割。每个帽可捕获多个细胞体。[关键步骤：为避免RNA降解，整个分析过程（包括脱水和显微切割）的总时间应控制在45分钟以内。]
- 所有目标细胞捕获完成后，取下带有显微切割细胞的HS LCM帽，将其放置在干净的载玻片上，以确认捕获细胞的存在，并目视检查帽上是否存在非目标细胞或碎片。
4. 来自激光显微切割细胞的 RNA 分离
- 将含有显微切割细胞的管盖连接到 ExtracSure（Molecular Devices）装置上。向含有细胞的管盖表面加入 12μl RNA 提取缓冲液（PicoPure，Molecular Devices），并将倒置的薄壁反应管（GeneAmp，Applied Biosystems）连接至 ExtracSure 装置。将组装好的装置置于对齐托盘（Molecular Devices）上，并用已在培养箱中预热至 42°C 的孵育块（Molecular Devices）覆盖。
- 经过 30 分钟孵育后，将含有提取物的管子在 800 ×g 条件下离心 2 分钟。关闭管盖，将细胞提取物储存在 -80°C，直至进行 RNA 纯化。
暂停点
- 根据 PicoPure（Molecular Devices）RNA 提取试剂盒说明书提取 RNA 并进行柱纯化。DNA酶处理为可选步骤，可根据需要在柱上纯化过程中进行。如有需要，可在纯化过程中将多个 LCM 样本合并至同一根纯化柱中，以提高最终 RNA 产量，并用较小体积（11–30 μl）的洗脱缓冲液（PicoPure，Molecular Devices）洗脱，随后于 -80°C 保存直至使用。如需评估，可取 1 μl 洗脱液使用 Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies, Inc.）检测总 RNA 质量。
代表性结果
激光捕获显微切割（LCM）用于分离单个、类别特异性或多个 果蝇 三龄幼虫的da神经元（图1）。LCM技术能够在分离过程中实现高度的精确性和特异性 果蝇 da神经元细胞体（图2a-c）。此外，从这些分离的da神经元中纯化的总RNA质量极佳，Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies, Inc.）分析显示清晰的5.8S、18S和28S核糖体RNA峰（图2d）。
为了评估分离细胞中神经元特异性的富集程度，我们采用神经元基因特异性标记物 elav 进行实时定量反转录 PCR（qRT-PCR）分析。在 qRT-PCR 分析中，我们计算了激光捕获显微切割（LCM）分离的 da 神经元中 elav 表达的相对水平，并使用 ΔΔCt 方法将其相对于内源性对照 (rp49) 进行归一化，同时以整个幼虫中提取的总 RNA 作为参照23。分析结果显示，与整个动物样本相比，LCM 显微切割的 da 神经元样本中 elav 的相对表达水平富集超过 2.5 倍（图 3）。
图1：Drosophila 外周神经元的激光显微切割（LCM）。(a) 选择年龄匹配的三龄幼虫，清洗后 (b) 用OCT包埋并置于-80°C冷冻，(c) 使用标准冷冻切片机切出8μm连续组织切片，并 (d) 均匀贴附于洁净载玻片上。附着组织切片的载玻片在LCM处理前保存于-80°C。 (e,f) 在进行LCM前，将组织切片解冻，短暂用70%乙醇固定，随后用ddH2O快速漂洗。 (g) 将载玻片短暂与胰蛋白酶孵育，再用ddH2O漂洗，以去除幼虫切片中的角质层（黑色）。 (h,i) 去除幼虫角质层后的组织切片再经梯度乙醇脱水，最后用二甲苯透明。 (j) 将带有热敏性聚合物的LCM帽置于组织切片上，激光脉冲照射选定的荧光细胞体。激光脉冲使聚合物熔化并包裹目标细胞体。连同捕获细胞体的聚合物帽被提起后，(k) 向细胞中加入RNA提取缓冲液。捕获的细胞与RNA提取缓冲液在42°C孵育30分钟，之后可选择保存于-80°C，或直接进行RNA纯化处理。
图2：激光显微切割（LCM）实现对da神经元的高精度捕获。（a） 进行LCM前经脱水和胰蛋白酶处理的8微米组织切片代表性图像，显示由ppk-GAL4,UASmCD8::GFP报告品系标记的两个IV型多树突（class-IV da）神经元，其中GFP荧光标记清晰可见。注意，其中一个神经元已被标出（箭头），用于后续捕获。（b） 被标出的神经元（箭头）胞体从组织切片中被干净且特异性地显微切割下来。（c） 捕获在LCM帽上的单个IV型多树突da神经元的端面视图。（d） 从LCM获取的da神经元中提取的总RNA经Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies, Inc.）检测所得电泳图，显示优良的RNA质量，表现为清晰的5.8S、18S和28S核糖体RNA（rRNA）峰。
图3：qRT-PCR显示，在激光显微切割捕获的da神经元中，神经元标志基因表达相对于整体动物显著富集。 对激光显微切割捕获的da神经元 (21-7-GAL4,UAS-mCD8::GFP) 及同龄三龄幼虫整体动物中的神经元特异性标志基因 (elav) 表达进行qRT-PCR分析，每组设三个重复。采用ΔΔCt法23，将激光显微切割捕获的da神经元中elav基因的相对表达水平以内源性对照(rp49)归一化，并相对于整体幼虫进行比较。结果显示，激光显微切割捕获的da神经元样本中elav的相对表达水平较整体动物提高2.5倍。
故障排除
问题：RNA降解或质量较低。
整个实验过程中确保无RNase环境。尽量将每张切片的激光显微切割（LCM）操作时间缩短至30分钟以内。除进行激光显微切割外，切片和样品均应置于干冰上保存。组织切片一旦切好，应避免反复冻融。
问题：在胰蛋白酶处理过程中（步骤 17-18），大多数细胞从载玻片上脱落。
尝试缩短胰蛋白酶处理时间。尝试降低胰蛋白酶浓度。
问题：帽状聚合物上存在角质层及其他非特异性组织碎片。
尝试用胶粘便签的粘性表面轻压聚合物表面，以去除组织碎片22。
问题：LCM 效率低。
尝试延长在100%乙醇和二甲苯中的孵育时间。使用除湿机降低室内湿度。
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讨论
本文所述方案介绍了我们通过激光显微切割（LCM）分离 Drosophila 外周神经元的优化方法。尽管该LCM方案专为从三龄幼虫发育阶段特异性分离单个、类别特异或多个 Drosophila da神经元而设计，但对该方案进行轻微修改后，即可轻松适用于利用不同的 GAL4,UAS-mCD8-GFP 报告转基因标记并捕获各发育阶段的其他 Drosophila 细胞类型。我们的结果表明，通过激光显微切割获取的da神经元RNA质量极高，可直接用于qRT-PCR或基于微阵列的分析。该方案的应用不仅限于本文讨论的野生型目标细胞的捕获，还可将LCM与功能缺失（UAS-RNAi）和/或功能获得研究相结合，利用 GAL4/UAS 系统在特定细胞类型中开展研究。
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致谢
感谢 Yuh-Nung Jan 博士和 Wes Grueber 博士提供本研究中使用的果蝇品系，感谢 Virginia Espina、Emanuel Petricoin 博士和 Lance Liotta 博士在激光显微切割技术（LCM）方面的协助。作者感谢 Thomas F. 和 Kate Miller Jeffress 纪念信托基金对本研究的支持（D.N.C.），以及乔治梅森大学校长办公室（E.P.R.I.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS） | MP Biomedicals | PBS10X02 | 稀释至1X工作液 |
| 2.5% 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | |
| 二甲苯，组织学级 | Fisher Scientific | X3S-4 | |
| 无RNA酶水 | Fisher Scientific | BP561-1 | |
| 最佳切割温度（OCT）包埋剂 | Tissue-Tek | 4583 | |
| PicoPure RNA 提取试剂盒 | Molecular Devices | KIT0204 | 遵循制造商说明’s 指令 |
| 带圆顶盖的薄壁反应管 | 应用生物系统公司 | N8010611 | |
| ExtracSure 样本提取装置 | Molecular Devices | LCM 0208 | |
| CapSure HS 胶帽样本提取用孵育块 | Molecular Devices | LCM0505 | |
| CapSure HS 激光显微切割帽和ExtracSure样本提取装置的对齐托盘 | Molecular Devices | LCM0504 | |
| CapSure HS LCM 帽盖 | Molecular Devices | LCM0213 | |
| 75x100 毫米载玻片 | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| 组织包埋模具 | Fisher Scientific | NC9642669 | |
| 适用于1.5 ml微量离心管的聚丙烯研磨杵 | USA Scientific, Inc. | 1415-5390 | |
| 70% 乙醇；95% 乙醇；100% 乙醇 | |||
| 干冰 | |||
设备：
|
参考文献
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