激光捕获显微切割 果蝇 外周神经元

摘要

在本视频文章中，我们介绍了一种利用红外捕获（IR）型激光显微切割技术（LCM）从三龄幼虫中分离单个或多个黑腹果蝇（Drosophila）da神经元的方法。从分离的神经元中获得的RNA可直接用于后续实验，包括定量逆转录PCR（qRT-PCR）或微阵列分析。

摘要

果蝇外周神经系统（PNS）中的树突分支（da）神经元为研究特定类型树突形态发生的分子机制提供了一个极佳的模型系统^1,2。为了促进对特定类型da神经元发育的分子分析，至关重要的是获得高纯度的此类细胞群体。尽管目前已存在多种针对果蝇细胞的细胞或组织特异性RNA分离技术，包括基于磁珠的细胞纯化^3,4、荧光激活细胞分选（FACS）^5-8以及基于RNA结合蛋白的策略⁹，但这些方法均难以实现对单个或多个特定类型的果蝇da神经元进行具有高空间精度的分离。激光显微切割（LCM）作为一种极为强大的工具，已可用于从组织切片中以高空间分辨率和准确性分离特定类型的细胞。从分离得到的细胞中提取的RNA，可进一步用于特定细胞类型的分析，包括qRT-PCR和微阵列表达谱分析^10-16。迄今为止，LCM在果蝇组织和细胞分析中的应用仍较为有限^17,18，包括对三龄幼虫发育阶段的da神经元的研究。

在此，我们展示了优化的小胶质细胞分离方案 果蝇 使用红外（IR）类激光显微切割技术（LCM）分离da神经元。该方法可高特异性、高空间分辨率地捕获单个、特定类别或多个da神经元。选取表达相应标记物的同龄三龄幼虫进行实验。 UAS-mCD8::GFP¹⁹ 由IV类da神经元特异性启动子调控的转基因 ppk-GAL4²⁰ 驱动基因或 pan-da 神经元特异性 21-7-GAL4²¹ 驱动基因用于这些实验。从分离的da神经元中获得的RNA质量非常高，可直接用于后续应用，包括qRT-PCR或微阵列分析。此外，该LCM方案可轻松调整以捕获其他 果蝇 不同细胞类型在发育的各个阶段，依赖于细胞类型特异性 GAL4-GFP的驱动表达模式

方案

激光显微切割（LCM）的一般注意事项 果蝇 外周神经元

根据组织类型和所需细胞数量，激光显微切割（LCM）的时间可从6小时到一周甚至更长时间不等。

所有操作均在严格无RNA酶的条件下，按照标准流程进行。本实验使用了表达 21-7-GAL4,UAS-mCD8::GFP 或 ppk-GAL4,UAS-mCD8::GFP 转基因报告基因品系的幼虫。

1. 幼虫的准备

1. 收集30-40只年龄相匹配的三龄幼虫，用ddH₂O清洗，随后用RNAse Away（Sigma-Aldrich）短暂漂洗，最后再用ddH₂O洗涤以去除残留的RNAse Away。在将幼虫包埋于OCT包埋剂之前，用洁净的Kimwipe纸彻底吸去多余的ddH₂O。
2. 取一个洁净的组织包埋模具，在其中铺上一层薄薄的OCT（厚度1.5-2 mm），足以覆盖单层幼虫即可。
3. 在包埋幼虫前，如需要，可将含有OCT的包埋模具置于冰块上，使OCT冷却至0°C。此步骤有助于减少包埋过程中幼虫的移动。
4. 将洁净的幼虫放置在预冷的OCT表面，并彼此平行排列。待幼虫排布完成后，缓慢加入OCT填充模具，注意避免扰动幼虫排列。将模....

讨论

本文所述方案介绍了我们通过激光显微切割（LCM）分离 Drosophila 外周神经元的优化方法。尽管该LCM方案专为从三龄幼虫发育阶段特异性分离单个、类别特异或多个 Drosophila da神经元而设计，但对该方案进行轻微修改后，即可轻松适用于利用不同的 GAL4,UAS-mCD8-GFP 报告转基因标记并捕获各发育阶段的其他 Drosophila 细胞类型。我们的结果表明，通过激光显微切割获取的da神经元RNA质量极高，可直接用于qRT-PCR或基于微阵列的分析。该方案的应用不仅限于本文讨论的野生型目标细胞的捕获，还可将LCM与功能缺失（UAS-RNAi）和/或功能获得研究相结合，利用 GAL4/UAS 系统在特定细胞类型中开展研究。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）	MP Biomedicals	PBS10X02	稀释至1X工作液
2.5% 胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T1426
RNase-AWAY	Sigma-Aldrich	83931
二甲苯，组织学级	Fisher Scientific	X3S-4
无RNA酶水	Fisher Scientific	BP561-1
最佳切割温度（OCT）包埋剂	Tissue-Tek	4583
PicoPure RNA 提取试剂盒	Molecular Devices	KIT0204	遵循制造商说明’s 指令
带圆顶盖的薄壁反应管	应用生物系统公司	N8010611
ExtracSure 样本提取装置	Molecular Devices	LCM 0208
CapSure HS 胶帽样本提取用孵育块	Molecular Devices	LCM0505
CapSure HS 激光显微切割帽和ExtracSure样本提取装置的对齐托盘	Molecular Devices	LCM0504
CapSure HS LCM 帽盖	Molecular Devices	LCM0213
75x100 毫米载玻片	Fisher Scientific	12-544-3
组织包埋模具	Fisher Scientific	NC9642669
适用于1.5 ml微量离心管的聚丙烯研磨杵	USA Scientific, Inc.	1415-5390
70% 乙醇；95% 乙醇；100% 乙醇
干冰
设备： <李>冷冻切片机<李>用于切片固定、冲洗、胰蛋白酶处理以及乙醇/二甲苯脱水的50 ml锥形管<李>-80°C 冷冻室<李>培养箱<李>PixCell IIe LCM 显微切割系统，配备针对EGFP优化的Fluor 300落射荧光光学装置（Molecular Devices-Molecular Devices）