以下方案节选自 戴维斯 等 一种用于测量乙醇对运动速度影响的检测方法 秀丽隐杆线虫, 视频实验杂志 (2015).
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实验前一天需执行的步骤
- 挑选L4期线虫转移到接种了OP50 E. coli菌苔的新鲜线虫生长培养基（NGM）平板上，并于20 ˚C过夜培养。每个实验条件需要10条线虫；应多挑选一些线虫以补偿过夜期间可能的损失。
- 仅使用第一天成虫阶段的个体进行实验；许多突变体的生长速度比野生型慢。对于发育延迟的品系，应调整挑选时间，确保所有测试个体均为第一天成虫。
- 实验当天需执行的步骤
- 实验前准备：
- 在标准未接种的60 × 15 mm NGM平板上进行实验。将所有待用平板在37 ˚C下敞盖干燥2小时。每次实验需使用四个干燥后的NGM平板；分别为0 mM和400 mM乙醇实验平板及其对应的适应平板。
注意：此处使用NGM平板非常重要；平板成分的差异，尤其是其渗透压，会显著影响乙醇对行为的剂量反应，部分原因在于线虫体内乙醇积累量的变化。NGM琼脂的渗透压为160 mOsm。
- 干燥后，称量每个未接种NGM平板的重量并记录。根据空板重量确定平板中培养基的体积。为估算琼脂重量与体积的换算关系，可假设培养基的密度与等体积水相同。
注意：我们获得最一致结果的NGM培养基经充分脱水后，原始10 ml体积在干燥后应介于8.3–8.9 ml之间。作为2小时干燥时间的替代方案，可根据培养箱差异将干燥时间调整至平板达到此体积范围为止。
- 将4个铜环（内径1.6 cm）熔入每个平板表面，用于分隔不同基因型或处理组的线虫。用镊子夹住每个铜环，在火焰中加热约3秒（本生灯的强火焰效果较好），然后立即在仍用镊子夹持的情况下将铜环放置于平板上，以防其“跳动”。
- 用镊子在铜环多个位置轻轻下压，确保铜环平整贴合琼脂表面。放置铜环时，注意为其余三个铜环预留足够空间。
- 将另外三个铜环依次熔入平板表面，尽量使四个铜环彼此靠近，以便全部位于摄像机视野范围内。
注意：铜环与琼脂之间形成良好密封至关重要，以防止实验过程中线虫逃出。在平板上跳动的铜环难以与琼脂形成正确密封，可能划伤琼脂表面，导致线虫钻入并干扰观察。
- 为每个实验平板准备一个对应的“适应”平板，该平板也需干燥且未接种，且不添加乙醇。在这些平板上同样放置四个铜环。
- 在平板底部靠近每个铜环的位置标注该铜环中将使用的线虫品系，注意不要在铜环本身的视野范围内书写。确保实验平板上的标签与其对应的适应平板一致。
- 计算需添加至每个实验平板的100%乙醇量，使最终浓度分别为0 mM或400 mM（质量/体积比）。每次实验（n = 1）需准备一个0 mM和一个400 mM乙醇平板；适应平板不添加乙醇。用移液器将乙醇均匀滴加至平板表面，然后用实验室封口膜密封平板，在室温下平衡2小时。
- 当时间过去1.5小时后，开始进行实验的适应步骤（步骤2.2）。
- 进行运动行为实验：实验平板操作
- 小心地将每组实验线虫各10条转移至适应平板上铜环的中心位置。此时用线虫挑针轻轻刮除琼脂表面可见的食物残留。在不同实验重复中，应改变各实验组上线虫放置的顺序，避免相同品系在每次实验中始终以相同顺序上板。
注意：目标是以最少的食物量将线虫转移至平板，因为若适应平板上的食物被带入实验平板，线虫会聚集在食物周围，从而掩盖药物对运动行为的影响。
- 操作时注意不要用挑针划破琼脂表面，否则会导致线虫钻入琼脂，干扰实验结果。将线虫在室温下孵育30分钟。
- 确保各平板启动之间有适当的时间间隔。经验丰富的实验人员可在<1.5分钟内完成40条线虫（每环10条，共4环）的转移，但最长间隔不超过2分钟 均可接受。标准实验中，对0 mM和400 mM乙醇处理组均在暴露10–12分钟 和30–32分钟 时进行录像。
- 启动0 mM乙醇暴露组的适应平板与400 mM乙醇暴露组的适应平板之间应间隔约2分钟 和30秒 ，以便在开始录制第二个视频前完成第一个视频文件的保存。
- 经过30分钟 的适应期后，将线虫从适应平板转移至实验平板。转移时应按照其在适应平板上的添加顺序，将线虫依次转移至相应的实验平板（0 mM或400 mM乙醇），并记录各平板完成转移的时间间隔。用实验室封口膜密封平板，以尽量减少乙醇挥发损失。
- 使用边缘较薄且扁平的线虫挑针，以“舀取”动作将线虫收集至挑针平面上。在将线虫从未接种的适应平板转移至实验平板时，不要使用细菌（通常用于帮助粘附线虫至挑针），以免引入食物污染。
注意：此步骤中线虫转移的速度非常关键，因为先上板的线虫暴露于乙醇的时间长于后上板的线虫，早期时间点可能出现一定的时间依赖性效应。因此，在不同实验重复中轮换各品系首次上板的顺序是十分重要的。
- 进行运动行为实验：录像
- 使用显微镜/相机组合系统，确保能同时成像全部四个铜环所在的视野范围（约42×42 mm2 正方形区域），例如采用0.5倍显微镜物镜、0.8倍放大倍率，以及配备2048×2048、7.4 µm像素CCD的相机。
- 确保整个视野内照明均匀，有助于在强度阈值步骤中实现目标识别。使用3”×3”背光源效果良好。
- 将平板以培养基面朝上（盖子朝下）的方式成像，这种设置相比传统显微镜透射光源能产生更好的对比度，尽管使用背光时部分对比度会有所损失。
- 设置图像分析软件以采集移动线虫的时间序列视频。设定软件每1秒采集一帧12位灰度图像，生成一段2分钟 （共120帧）的视频。为减小输出文件大小同时保留足够的图像分辨率，可采用2×2像素合并模式采集1024×1024像素的图像。
- 开始录像。在最后一条线虫被放置到第一个平板（0 mM乙醇）后10分钟 ，开始录制该平板的120帧视频。录制完成后保存视频文件。
- 接着录制第二个平板（400 mM乙醇）。重复此过程，在第一个平板（0 mM乙醇）上最后一条线虫放置后30分钟 开始录制第二个平板，以获取各处理组在30–32分钟 时间点的数据。
注意：每次录像结束后，应留出足够时间保存图像文件，再开始下一个待分析平板的录制。
- 为便于未来长期保存录像资料，并使这些视频可被ImageJ等其他公共领域开源图像分析软件打开和分析，建议将每段视频另存为8位256级灰度TIFF格式文件。
注意：此处描述的图像分析软件使用专有文件格式。