人T淋巴细胞的分离、培养及迁移分析 体外

摘要

T淋巴细胞迁移发生于归巢至淋巴器官、血管外渗以及进入外周组织的过程中。本文介绍了一种可用于分析T淋巴细胞迁移的实验方案 体外.

摘要

T淋巴细胞的迁移涉及细胞表面整合素与表达在其他细胞上的配体或细胞外基质蛋白之间的黏附相互作用。整合素在细胞前缘从低亲和力状态精确地时空激活为高亲和力状态，对于T淋巴细胞的迁移至关重要。¹同样，细胞尾部边缘（即尾突）的回缩是维持整合素依赖性T淋巴细胞持续运动的必要步骤。²许多针对自身免疫性疾病或炎症性疾病的治疗策略以整合素为靶点，旨在抑制白细胞的过度募集和迁移。³. 为了研究调控人T淋巴细胞迁移的分子事件，我们采用了in vitro用于分析T淋巴细胞在二维基质上迁移的系统，该基质模拟了T淋巴细胞从血管中被募集时所处的微环境。首先从人类供体中分离T淋巴细胞，随后对其进行刺激并培养7至10天。在实验过程中，使T淋巴细胞黏附并迁移于涂有细胞间黏附分子-1（ICAM-1，整合素LFA-1的配体）和基质细胞衍生因子-1（SDF-1）的基质表面。我们的数据显示，T淋巴细胞的迁移速度约为15 μm/min。T淋巴细胞的迁移可被整合素阻断所抑制¹或通过调节细胞迁移的细胞肌动球蛋白机器的抑制剂².

方案

1. 人T淋巴细胞的分离

1. 从健康供体获取人血。在进行下一步操作前，将血液置于室温下冷却约30分钟。
2. 用移液器轻轻将3 mL室温的Polymorph密度梯度分离液加入到8 mL圆底聚苯乙烯管中。再轻轻将3 mL全血加至Polymorph分离液上方，注意避免两种试剂混合。
3. 将试管在室温下以500 × g离心45分钟。
4. 离心后，外周血单个核细胞（PBMC）已与其他血液成分分离，位于上层细胞层。从上往下观察，PBMC层呈现为第一层浑浊的条带。
5. 小心移除PBMC层上方的澄清黄色上清液，然后使用P1000移液器将PBMC层转移至15 mL或50 mL锥形管中。
6. 用PBS洗涤PBMC两次，每次以500 × g离心5分钟。每次洗涤后上清液会略显浑浊。

2. 人T淋巴细胞的培养

1. 使用移液器将PBMC转移至含有20 mL RPMI 1640培养基的T-75培养瓶中，培养基中需添加10% FBS、1%青霉素/链霉素和1 μg/mL植物血凝素（PHA）。
2. 在37°C、5% CO₂条件下孵育至少1小时，最长可达24小时。此步骤可使贴壁于培养瓶表面的单核细胞与仍悬浮在培养基中的淋巴细胞分离。若在此步骤中采用短时间孵育（1小时），可使用不含PHA的RPMI 1640培养基（含10% FBS和1%青霉素/链霉素），如步骤2.1所述。
3. 小心吸去培养瓶中的全部培养基，将其转移至50 mL锥形管中，并在500 × g下离心5分钟。
4. 重悬细胞沉淀（此时主要含有淋巴细胞），并将细胞转移至新的T-75培养瓶中，培养瓶内含25 mL RPMI 1640培养基，其中添加10% FBS、1%青霉素/链霉素和1 μg/mL PHA。
5. 在37°C下培养3天（若PBMC初始孵育过夜，则培养2天）。细胞生长24小时后，可能需要添加15–20 mL新鲜培养基，并转移至更大的T-175培养瓶中。
6. 培养3天后，使用移液器将培养基和悬浮的淋巴细胞从培养瓶中移出，转移至50 mL锥形管中，在500 × g下离心5分钟。
7. 重悬细胞沉淀，并将细胞转移至新的T-75或T-175培养瓶中，分别加入25 mL（T-75）或50 mL（T-175）RPMI 1640培养基，其中含10% FBS、1%青霉素/链霉素以及20 ng/mL人IL-2或IL-15。
8. 继续培养淋巴细胞4–7天。若起始使用T-75培养瓶，培养1–2天后需扩大培养规模并转移至T-175培养瓶。

3. 体外 淋巴细胞迁移实验

1. 在进行迁移实验的前一天，用 PBS 配制的 20 μg/mL Protein A 或 G 在 4°C 过夜包被玻璃底 0.17 mm 培养皿。
2. 用 PBS 充分洗涤培养皿。
3. 将人 ICAM-1/Fc（10 μg/mL）和人 SDF-1（2 μg/mL）溶于 PBS 溶液中加入培养皿，室温孵育 4 小时，以实现固定化。
4. 使用血细胞计数板测定 T-175 培养瓶中培养物的细胞密度，从而制备 T 淋巴细胞。每皿应使用约 2–5 × 10⁵ 个细胞，以达到适合迁移分析的细胞密度。
5. 用 PBS 洗涤 T 淋巴细胞两次，然后重悬于含 1 mg/mL D-葡萄糖的 1 mL L-15 培养基中。
6. 用 PBS 充分洗涤包被有 ICAM-1/Fc 和 SDF-1 的培养皿。
7. 将 1 mL 培养基中的 T 淋巴细胞转移至培养皿中，并在 37°C 下维持培养。

4. 使用 NIS Elements 软件采集图像序列

1. 打开 NIS Elements 软件。
2. 在相机设置菜单中，为实时成像和图像采集均选择“2x2 二倍像素合并”模式。
3. 进入“应用程序”菜单，选择“定义/运行实验”。
4. 设定图像之间的时间间隔以及图像采集序列的总时长。
5. 点击“运行”按钮以开始图像采集。
6. 可使用多种软件包（包括 ImageJ、AutoQuant 或 Volocity）对细胞进行追踪，并量化迁移参数（如速度、路径长度、位移等）（图 1）。
7. 为生成“蜘蛛网图”，需收集每个细胞在各时间点的 x-y 坐标（图 2），并将这些坐标投影到一张图中，使每个细胞的起始点均位于原点（图 3）。

5. 代表性结果

在含有 IL-2 或 IL-15 的培养条件下培养第 6 天时，T 淋巴细胞占细胞总数的 >98%，通过 CD3 阳性染色以及 CD4 和/或 CD8 阳性染色确定。在 IL-2 条件下，我们发现 CD4+ 细胞占 83%，CD8+ 细胞占 15%，<1% 为 CD4+CD8+ 双阳性细胞。在 IL-15 条件下，CD4+ 细胞占 88%，CD8+ 细胞占 11%，<1% 为 CD4+CD8+ 双阳性细胞。T 淋巴细胞在 ICAM-1/SDF-1 基质上迁移时，表现出约 15 μm/min 的迁移速度，并可持续长达 1 小时。T 淋巴细胞在 ICAM-1/SDF-1 上的迁移依赖于 LFA-1 介导的黏附，因为抗 LFA-1 配体阻断抗体可显著抑制其迁移。

图1. 迁移性T淋巴细胞的细胞追踪。 从全血中分离的T淋巴细胞在IL-2或IL-15存在下培养6天后，接种于包被有10 μg/mL ICAM-1和2 μg/mL SDF-1的玻璃底培养皿上，使其贴附并迁移。每10秒采集一次图像，持续30分钟。使用Volocity软件在每幅图像中识别细胞并进行时间序列追踪。该视频显示T淋巴细胞以约15 μm/min的速度进行随机迁移。

点击此处观看视频。
视频 1. 迁移性 T 淋巴细胞的细胞追踪。从全血中分离的 T 淋巴细胞在 IL-2 或 IL-15 存在下培养 6 天后，接种于包被有 10 μg/mL ICAM-1 和 2 μg/mL SDF-1 的玻璃底培养皿中，使其贴附并迁移。每 10 秒采集一次图像，持续 30 分钟。使用 Volocity 软件对每幅图像中的细胞进行识别并随时间追踪。该视频展示了 T 淋巴细胞以约 15 μm/min 的速度进行随机迁移的过程。

图2. 细胞的时空位置。使用Volocity软件获取每个时间点各个细胞的X-Y坐标。

图3. “蜘蛛网图”。利用每个细胞的X-Y-t坐标，随机选取15个细胞，并以原点为共同起点进行绘制。通过比较蜘蛛网图，可以直观快速地展示不同实验条件下细胞迁移的差异。左图显示对照条件下T淋巴细胞的迁移情况，右图显示存在抗LFA-1配体阻断抗体时T淋巴细胞的迁移情况。

讨论

在本实验中，我们详细介绍了一种用于分析原代人T淋巴细胞运动能力的简易系统。体外迁移实验已被广泛用于解析多种分子及信号通路在不同类型细胞运动中的作用。在依据本方案设计您自己的实验时，需注意一些关键对照条件，包括：1）使用非黏附性或非整联蛋白介导的黏附性底物包被，例如牛血清白蛋白（BSA）或聚-L-赖氨酸（PLL）；2）使用特异性阻断整联蛋白的抗体处理，以确定整联蛋白的功能特异性；3）在无刺激信号的情况下进行共包被，例如本方案中所述的SDF-1。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	GIBCO，由 Life Technologies 生产	11875
FBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH300070.03
青霉素-链霉素	GIBCO，由 Life Technologies 生产	15140
1-Step Polymorphs	Accurate Chemical & Scientific Corporation	AN221725
PHA	Remel, Thermo Fisher Scientific	R30852801
重组人 IL-2	R&D Systems	202-IL
重组人 IL-15	R&D Systems	247-IL
Protein G	Sigma-Aldrich	19459
重组人 ICAM-1/Fc	R&D Systems	720-IC
重组人 SDF-1	R&D Systems	350-NS