人T淋巴细胞的分离、培养及迁移分析 体外

摘要

T淋巴细胞迁移发生于归巢至淋巴器官、血管外渗以及进入外周组织的过程中。本文介绍了一种可用于分析T淋巴细胞迁移的实验方案 体外.

摘要

T淋巴细胞的迁移涉及细胞表面整合素与表达在其他细胞上的配体或细胞外基质蛋白之间的黏附相互作用。整合素在细胞前缘从低亲和力状态精确地时空激活为高亲和力状态，对于T淋巴细胞的迁移至关重要。¹同样，细胞尾部边缘（即尾突）的回缩是维持整合素依赖性T淋巴细胞持续运动的必要步骤。²许多针对自身免疫性疾病或炎症性疾病的治疗策略以整合素为靶点，旨在抑制白细胞的过度募集和迁移。³. 为了研究调控人T淋巴细胞迁移的分子事件，我们采用了in vitro用于分析T淋巴细胞在二维基质上迁移的系统，该基质模拟了T淋巴细胞从血管中被募集时所处的微环境。首先从人类供体中分离T淋巴细胞，随后对其进行刺激并培养7至10天。在实验过程中，使T淋巴细胞黏附并迁移于涂有细胞间黏附分子-1（ICAM-1，整合素LFA-1的配体）和基质细胞衍生因子-1（SDF-1）的基质表面。我们的数据显示，T淋巴细胞的迁移速度约为15 μm/min。T淋巴细胞的迁移可被整合素阻断所抑制¹或通过调节细胞迁移的细胞肌动球蛋白机器的抑制剂².

方案

1. 人T淋巴细胞的分离

1. 从健康供体获取人血。在进行下一步操作前，将血液置于室温下冷却约30分钟。
2. 用移液器轻轻将3 mL室温的Polymorph密度梯度分离液加入8 mL圆底聚苯乙烯管中。然后轻轻将3 mL全血加至Polymorph分离液上方，注意避免两种试剂混合。
3. 将试管在室温下以500 × g离心45分钟。
4. 离心后，外周血单个核细胞（PBMC）已与其他血液成分分离，位于上层细胞层。从顶部观察，PBMC层呈现为第一层浑浊的条带。
5. 小心移除PBMC层上方的澄清黄色上清液，然后使用P1000微量移液器将PBMC层转移至15 mL或50 mL锥形管中。
6. 用PBS洗涤PBMC两次，每次以500 × g离心5分钟。每次洗涤后上清液会略显浑浊。

2. 人T淋巴细胞的培养

1. 使用移液器将PBMC转移至含有20 mL RPMI 1640培养基的T-75培养瓶中，培养基中需添加10% FBS、1%青霉素/链霉素和1 μg/mL植物血凝素（PHA）。
2. 在37°C、5% CO₂条件下孵育至少1小时，最长可达24小时。此步骤可使贴壁于培养瓶表面的单核细胞与仍悬浮在培养基中的淋巴细胞分离。若在此步骤中采用短时间孵育（1小时），可使用仅含10% FBS和1%青霉素/链霉素的RPM....

讨论

在本实验中，我们详细介绍了一种用于分析原代人T淋巴细胞运动能力的简易系统。体外迁移实验已被广泛用于解析多种分子及信号通路在不同类型细胞运动中的作用。在依据本方案设计您自己的实验时，需注意一些关键对照条件，包括：1）使用非黏附性或非整联蛋白介导的黏附性底物包被，例如牛血清白蛋白（BSA）或聚-L-赖氨酸（PLL）；2）使用特异性阻断整联蛋白的抗体处理，以确定整联蛋白的功能特异性；3）在无刺激信号的情况下进行共包被，例如本方案中所述的SDF-1。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	GIBCO，由 Life Technologies 生产	11875
FBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH300070.03
青霉素-链霉素	GIBCO，由 Life Technologies 生产	15140
1-Step Polymorphs	Accurate Chemical & Scientific Corporation	AN221725
PHA	Remel, Thermo Fisher Scientific	R30852801
重组人 IL-2	R&D Systems	202-IL
重组人 IL-15	R&D Systems	247-IL
Protein G	Sigma-Aldrich	19459
重组人 ICAM-1/Fc	R&D Systems	720-IC
重组人 SDF-1	R&D Systems	350-NS