新型水箱潜水实验：一种研究斑马鱼先天应激反应的方法

摘要

来源：Chin J.S.R.，等。斑马鱼先天应激行为学研究方法。J. Vis. Exp.（2019）

本文介绍了一种评估斑马鱼应激反应的行为学方法。斑马鱼在受到应激刺激时，倾向于在水箱底部游动，直至应激源被移除。本文提供的示例方案详细描述了实施该检测的逐步操作流程。

方案

1. 新型水箱实验装置

1. 准备一个装有鱼系统用水的250 mL烧杯，以及至少两个暂养缸。
2. 在测试当天早晨，从鱼类饲养设施中将至少10条用于每个实验条件（对照组和实验组成鱼）的成年斑马鱼转移至一个暂养缸中，随后将其转移至行为实验房间，并使其适应环境至少一小时。
   注意：在实验前应进行功效分析，但在我们的实验中，n = 10 通常足以检测到统计学显著性。此外，暂养缸中每升水所容纳的个体数不应超过5条。适应时间为一小时已足够，因为已有研究表明成年斑马鱼在进入新鱼缸后30分钟内即可完成适应。同时，行为节律受昼夜节律过程影响，因此在不同日期进行的实验重复应尽量在相同时间段内完成。我们通常在上午11:00至下午6:00之间进行所有实验。
3. 对鱼缸进行标记，使实验操作者对动物的处理条件或基因型保持盲态。
   注意：可通过使用字母或数字系统（例如，一个鱼缸标记为“A”，另一个为“B”等）对鱼缸进行标记，从而轻松实现实验者的盲法操作。由不参与实验的人员使用该系统标记鱼缸，并在数据分析完成前对实验操作者隐藏其真实身份。
4. 使用渔网，将一条成年斑马鱼轻柔地从步骤1.1中的预装烧杯中放入。让成鱼在烧杯中适应10分钟。
   注意：记录成鱼的性别，因为在后续分析中可能需要考察性别特异性差异。
5. 在烧杯中适应结束后，通过将烧杯中的水和鱼轻柔倾倒的方式，将鱼引入新环境鱼缸（设置细节如下）。
   注意：本节步骤描述了新环境鱼缸实验的设置方法。最终装置示意图见图1B。
   1. 将新环境鱼缸放置在实验台中央。
   2. 将红外光源置于鱼缸后方，并在鱼缸与LED光源之间放置白色亚克力板或漫射屏。
   3. 调整漫射屏位置，使其最大限度地扩散来自LED的光线，同时确保光照强度足以照亮新环境鱼缸。漫射板越靠近光源，光线越亮，但扩散效果越差；相反，将漫射板远离光源可降低光强，但能更好地扩散光线。
   4. 用鱼系统用水填充新环境鱼缸约四分之三的容积。
      注意：系统用水通过将自来水进行反渗透处理后配制而成，随后进行调节，使电导率为900 ± 100 µS，pH为中性（7.2），温度维持在27 ± 1 °C。
   5. 将相机安装在相机支架上，并连接至计算机。打开视频采集软件，调整相机使其正对鱼缸前方，确保整个新环境鱼缸均在视频视野内，且无任何区域被遮挡。调整鱼缸和红外光源位置，使通过相机观察时，鱼缸内光照充足且均匀。
      注意：在正式开始实验前，通常可进行一次试运行，即录制一条鱼的视频并进行轨迹追踪，以确认当前设置是否满足行为实验的要求。
6. 将成鱼引入新环境鱼缸后，立即启动相机录像，并迅速离开实验装置区域，以避免对鱼类造成额外干扰。
7. 录像结束后，将个体从新环境鱼缸中取出，并转移至一个新的暂养缸中。
   注意：应使用与步骤1.2中不同的暂养缸，以防止对同一鱼类个体进行重复测试。

结果

图1. 新型水箱装置示意图。 （A）从记录侧观察到的1.8 L梯形新型水箱的尺寸。 （B）装置示意图，包括红外光源、摄像机以及用于减少人为干扰的屏障的位置。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
相机 			我们使用 Point Grey Grasshopper3 USB 相机，搭配 Edmund Optics 的镜头。
红外滤光片 	Edmund Optics
视频采集程序  			使用 Virtualdub 或 FlyCapture 等程序，因为可以设置采集帧率。
红外 LED 灯
实验水箱 	Aquaneering 	货号 ZT180 	规格：M3 1.8 升
支架和夹具，或标准相机三脚架
250 mL 烧杯
追踪软件 			我们使用 Noldus Information Technology 的 Ethovision XT 13