原代乳腺球生成：一种评估细胞潜能的技术

摘要

来源：Lombardo et. al.，《人乳腺癌组织和细胞系的乳腺球形成实验》，J. Vis. Exp. (2015年)。

本视频介绍了从乳腺癌细胞系中分离癌干细胞的方法。我们培养这些癌干细胞以生成原代乳腺球，用于评估其自我更新能力并计算成球效率，从而实现不同接种密度之间的比较。 

方案

1. 从人乳腺癌细胞系生成原代乳腺球

注意：以下步骤需在无菌培养罩内进行。

1. 准备含DMEM/F12的乳腺球培养基，添加2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素。在使用前立即加入20 ng/ml重组人表皮生长因子（EGF；Sigma）、10 ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF；R&D Systems）和1× B27补充剂，配制成完全培养基。
2. 吸除含有贴壁MCF-7或MDA-MB-231细胞（或其他选定的乳腺癌细胞系；70–80%融合度）的培养瓶中的培养基，用1× PBS洗涤两次，然后用胰蛋白酶消化细胞。
3. 将细胞在室温下以200 × g离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于1–5 ml乳腺球培养基中。反复吹打混匀，必要时使用带40 µm细胞滤器的盖子过滤，以获得单细胞悬液。使用血细胞计数板确认已形成单细胞悬液（若未完全分散，可用25 G针头将细胞悬液反复抽吸最多3次）。
4. 必要时，使用抗CD24-藻红蛋白（PE）和抗CD44-异硫氰酸荧光素（FITC）单克隆抗体通过FACS分离CD44+CD24-细胞亚群⁹。或者，按照制造商说明，使用抗CD44和抗CD24-生物素结合微珠，通过磁性激活细胞分选（MACS）系统分离该细胞群体。使用LS柱进行阳性分选，使用LD柱进行阴性分选，并通过流式细胞术确认所....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-谷氨酰胺	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml 青霉素 &和链霉素	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml 重组人表皮生长因子（EGF）	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	R&研发系统	233-FB-025
1x B27 添加剂	Invitrogen	17504-044
磷酸盐缓冲液（PBS）	赛默飞世尔科技	12399902
0.5% 胰蛋白酶/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
胎牛血清	英国首个链接	02-00-850
台盼蓝	Sigma Aldrich	93595
低吸附6孔板	康宁	CLS3814