原代乳腺球生成：一种评估细胞潜能的技术

摘要

来源：Lombardo et. al.，《人乳腺癌组织和细胞系的乳腺球形成实验》，J. Vis. Exp. (2015年)。

本视频介绍了从乳腺癌细胞系中分离癌干细胞的方法。我们培养这些癌干细胞以生成原代乳腺球，用于评估其自我更新能力并计算成球效率，从而实现不同接种密度之间的比较。 

方案

1. 从人乳腺癌细胞系生成原代乳腺球

注意：以下步骤需在无菌培养罩内进行。

1. 准备含DMEM/F12的乳腺球培养基，添加2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素。在使用前立即加入20 ng/ml重组人表皮生长因子（EGF；Sigma）、10 ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF；R&D Systems）和1× B27补充剂，配制成完全培养基。
2. 吸除含有贴壁MCF-7或MDA-MB-231细胞（或其他选定的乳腺癌细胞系；70–80%融合度）的培养瓶中的培养基，用1× PBS洗涤两次，然后用胰蛋白酶消化细胞。
3. 将细胞在室温下以200 × g离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于1–5 ml乳腺球培养基中。反复吹打混匀，必要时使用带40 µm细胞滤器的盖子过滤，以获得单细胞悬液。使用血细胞计数板确认已形成单细胞悬液（若未完全分散，可用25 G针头将细胞悬液反复抽吸最多3次）。
4. 必要时，使用抗CD24-藻红蛋白（PE）和抗CD44-异硫氰酸荧光素（FITC）单克隆抗体通过FACS分离CD44+CD24-细胞亚群⁹。或者，按照制造商说明，使用抗CD44和抗CD24-生物素结合微珠，通过磁性激活细胞分选（MACS）系统分离该细胞群体。使用LS柱进行阳性分选，使用LD柱进行阴性分选，并通过流式细胞术确认所有分离细胞的表型。
5. 使用台盼蓝染色法计算每毫升的活细胞数量。
   注意：活细胞率通过血细胞计数板网格内活细胞数占总细胞数的比例来计算。摄取台盼蓝的细胞视为非活细胞。以下步骤用于准确测定活细胞比例。
   1. 在PBS中配制0.4%台盼蓝溶液。将0.1 ml台盼蓝储存液加入1 ml细胞悬液中。混匀后立即加载至血细胞计数板，在显微镜下低倍镜观察。计数总细胞数和染成蓝色的细胞数。活细胞率 = [1.00 – (蓝色细胞数 ÷ 总细胞数)] × 100。
   2. 使用以下公式计算每毫升培养液中的活细胞数。注意校正稀释倍数。
      活细胞数 × 10⁴ × 1.1 = 细胞数/ml 培养液
6. 将预定数量的细胞重悬于2 ml完全乳腺球培养基中，接种至6孔超低吸附培养板的每孔中。接种密度通常为每孔500–4,000 个细胞/cm² 。可选：在24孔低吸附培养板中以相同密度接种，每孔加入0.5 ml培养基。
   注意：建议针对每种感兴趣的细胞系优化接种密度和培养时间。
7. 将超低吸附6孔板置于37 °C、5% CO₂ 条件下培养5–10天（根据细胞系及乳腺球大小而定），期间避免扰动培养板，尤其是在前5天的生长阶段。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-谷氨酰胺	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml 青霉素 &和链霉素	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml 重组人表皮生长因子（EGF）	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	R&研发系统	233-FB-025
1x B27 添加剂	Invitrogen	17504-044
磷酸盐缓冲液（PBS）	赛默飞世尔科技	12399902
0.5% 胰蛋白酶/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
胎牛血清	英国首个链接	02-00-850
台盼蓝	Sigma Aldrich	93595
低吸附6孔板	康宁	CLS3814