转导标记PDX肿瘤细胞：体外将表达荧光标记的慢病毒导入肿瘤细胞

摘要

来源：Hanna, C.，等. 利用可示踪报告基因标记乳腺癌患者来源的异种移植瘤用于肿瘤生长与转移研究。J. Vis. Exp. (2016)。

以下视频介绍了一种用于标记患者来源异种移植瘤（PDX）肿瘤细胞的转导技术，该技术通过慢病毒将表达绿色荧光蛋白和荧光素酶报告基因的载体导入肿瘤细胞 体外

方案

1. 来自PDX的肿瘤细胞的转导

1. 将解离的肿瘤细胞在300 g条件下离心5分钟，重悬于2 ml乳腺球培养基中。使用台盼蓝排斥法计数活细胞（将消化后的细胞重悬于5 ml洗涤缓冲液中，用台盼蓝排斥法计数活细胞和死细胞。简要步骤：混合50 µl细胞悬液与50 µl台盼蓝溶液，使用血细胞计数板计数未被台盼蓝染色的细胞）。
2. 配制10 ml含有8 µg/ml多聚素（polybrene）的乳腺球培养基（每毫升培养基中加入2 µl储存液）。
3. 确定含有2 × 10⁵个活肿瘤细胞所需的体积。在300 × g条件下离心细胞5分钟，将沉淀重悬于2 ml含多聚素的培养基中。将2 × 10⁵个活肿瘤细胞接种至6孔超低黏附组织培养板的每个孔中。
   注意：此为使用一种慢病毒载体进行转导所需的最适细胞数量。
   警告！ 慢病毒颗粒及其所有相关耗材的操作应遵循机构关于重组DNA生物危害物的处理规程。
   注意： 原代乳腺细胞的慢病毒转导更倾向于肌上皮细胞，可能导致腔面细胞标记效率低，并在标记过程中选择性富集某些肿瘤细胞亚群。
4. 转导前，将病毒与200 mU/ml神经氨酸酶在37 °C孵育1小时，以增强病毒颗粒与不同原代细胞亚群的结合能力，并校正这种潜在的偏倚。
5. 若PDX来源的解离细胞已去除Lin+小鼠细胞或富集了EpCam+细胞，则以10 MOI（2 × 10⁶ TU对应2 × 10⁵个活细胞）加入慢病毒颗粒；若使用未经富集的PDX解离细胞，则以30 MOI（6 × 10⁶ TU对应2 × 10⁵个活细胞）加入慢病毒颗粒。
   注意： 提高MOI可在粗提物中含有大量碎片和死细胞的情况下仍实现高效转导。保留一个孔不加病毒标记细胞，作为细胞活力和转导效率的对照。
6. 轻轻摇动混匀病毒与细胞。在37 °C、5% CO₂条件下孵育最多96小时。转导后24小时添加500 µl新鲜乳腺球培养基。细胞不会贴壁生长，请勿吸除培养基。

2. 免疫缺陷小鼠中标记细胞的转导效率评估与再移植

1. 使用荧光显微镜在10倍放大下每24小时监测一次可追踪标记（GFP）的表达情况。
   注意： 感染后最早可在24小时观察到GFP表达，但在大多数PDX模型中，GFP表达在72小时后才清晰可见（图1）。
2. 通过评估整个孔中GFP阳性细胞所占百分比，估算转导效率。
   注意： 由于培养物中含有不同程度的肿瘤细胞、残留的基质细胞和死亡细胞，因此即使GFP阳性细胞低至10%的孔也可用于移植到宿主小鼠体内。
3. 将转导后的细胞从6孔板转移至15 ml锥形管中。向孔中加入1 ml乳腺球培养基，以收集残留的所有细胞。置于冰上。
4. 向转导细胞中加入10 ml HBSS/HEPES，于4 °C下以300 × g离心5分钟。小心吸除上清液，并在冰上用50 µl基底膜基质提取物（BME）重悬细胞。
   注意： BME分装液必须在使用前1–2小时于冰上解冻。BME在室温下会凝固；请始终置于冰上保存。
5. 将嵌有BME的细胞吸入0.5 ml胰岛素注射器中，保持在冰上，并送至动物实验中心用于重新植入NSG小鼠体内。

结果

图1：在解离的PDX细胞中追踪转导效率。A) 经pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro慢病毒颗粒转导后24小时，富集人上皮细胞（Lin+耗竭）的PDX解离细胞。B) 另一独立实验中未进行上皮细胞富集的PDX解离细胞，在转导pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W后72小时。两个图示均显示活细胞。BF：明场图像，标尺代表50 µm

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12 (1:1)	Hyclone	SH30023.01
bFGF	BD 生物科学	354060
EGF	BD 生物科学	354001
肝素	Sigma	H4784
B27	吉布科/赛默飞世尔	17504-44
抗真菌抗生素	Hyclone	SV30010
无钙镁 HBSS 红色缓冲液	Hyclone	SH30031.02
Hepes
Cultrex	Cultrex	3433-005-01	基底膜提取物 (BME)
30 °C 摇床	NewBrunswick Scientific CO. INC	Series 25 恒温摇床