转导标记PDX肿瘤细胞：体外将表达荧光标记的慢病毒导入肿瘤细胞

摘要

来源：Hanna, C.，等. 利用可示踪报告基因标记乳腺癌患者来源的异种移植瘤用于肿瘤生长与转移研究。J. Vis. Exp. (2016)。

以下视频介绍了一种用于标记患者来源异种移植瘤（PDX）肿瘤细胞的转导技术，该技术通过慢病毒将表达绿色荧光蛋白和荧光素酶报告基因的载体导入肿瘤细胞 体外

方案

1. 来自PDX的肿瘤细胞的转导

1. 将解离的肿瘤细胞在300 g条件下离心5分钟，重悬于2 ml乳腺球培养基中。使用台盼蓝排斥法计数活细胞（将消化后的细胞重悬于5 ml洗涤缓冲液中，用台盼蓝排斥法计数活细胞和死细胞。简要步骤：混合50 µl细胞悬液与50 µl台盼蓝溶液，使用血细胞计数板计数未被台盼蓝染色的细胞）。
2. 配制10 ml含有8 µg/ml多聚素（polybrene）的乳腺球培养基（每毫升培养基中加入2 µl储存液）。
3. 确定含有2 × 10⁵个活肿瘤细胞所需的体积。在300 × g条件下离心细胞5分钟，将沉淀重悬于2 ml含多聚素的培养基中。将2 × 10⁵个活肿瘤细胞接种至6孔超低黏附组织培养板的每个孔中。
   注意：此为使用一种慢病毒载体进行转导所需的最适细胞数量。
   警告！ 慢病毒颗粒及其所有相关耗材的操作应遵循机构关于重组DNA生物危害物的处理规程。
   注意： 原代乳腺细胞的慢病毒转导更倾向于肌上皮细胞，可能导致腔面细胞标记效率低，并在标记过程中选择性富集某些肿瘤细胞亚群。
4. 转导前，将病毒与200 mU/ml神经氨酸酶在37 °C孵育1小时，以增强病毒颗粒与不同原代细胞亚群的结合能力，并校正这种潜在的偏倚。
5. 若PDX来源的解离细胞已去除L....

结果

图1：在解离的PDX细胞中追踪转导效率。A) 经pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro慢病毒颗粒转导后24小时，富集人上皮细胞（Lin+耗竭）的PDX解离细胞。B) 另一独立实验中未进行上皮细胞富集的PDX解离细胞，在转导pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W后72小时。两个图示均显示活细胞。BF：明场图像，标尺代表50 µm

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12 (1:1)	Hyclone	SH30023.01
bFGF	BD 生物科学	354060
EGF	BD 生物科学	354001
肝素	Sigma	H4784
B27	吉布科/赛默飞世尔	17504-44
抗真菌抗生素	Hyclone	SV30010
无钙镁 HBSS 红色缓冲液	Hyclone	SH30031.02
Hepes
Cultrex	Cultrex	3433-005-01	基底膜提取物 (BME)
30 °C 摇床	NewBrunswick Scientific CO. INC	Series 25 恒温摇床