共培养乳腺癌细胞：将乳腺癌细胞与骨碎片共培养以研究癌细胞增殖

摘要

来源：Templeton, Z. S，等。培养人股骨组织外植体以研究乳腺癌细胞定植转移微环境的方法。J. Vis. Exp （2015）。

本视频介绍了在股骨骨外植体附近培养乳腺癌细胞，以在人骨组织外植体模型系统中测量癌细胞增殖和定植的方法。

方案

1. 将乳腺癌细胞与骨碎片邻近共培养以使用生物发光成像测量乳腺细胞增殖

1. 实验前，制备含有 2 × 10⁵ 个乳腺癌细胞/50 µl 的细胞悬液，并准备骨蜡柱塞用于在培养过程中固定骨碎片。将一个 P200 移液器吸头切成三段，使用最大段的窄端以“饼干切割器”的方式切割出小块（约 35 mg）骨蜡。使用最小段的宽端将骨蜡柱塞推出并放入培养皿中储存。
2. 将一块骨蜡置于每个孔的12点钟位置，并用无菌手套的食指轻轻按压。
3. 用移液器将 50 µl 含有 1 × 10⁵ 个乳腺癌细胞的细胞悬液（溶于 DMEM-10% FBS + 青霉素-链霉素）加入6孔板每个孔的中央。（也可根据需要以分散模式接种细胞。）将培养板放入 37 °C 组织培养孵育箱中孵育 45 分钟，以促进细胞贴壁。
4. 为每个实验孔将一块骨碎片放置于一块骨蜡上，并使用咬骨钳施加轻柔压力以固定。每个实验组设三个重复，即从同一全髋关节置换术（THR）标本中取出的三块骨碎片置于上方三个孔中，而下方三个孔仅含骨蜡作为对照。
5. 使用 5 ml 移液器，沿每个孔的孔壁缓慢、轻柔地加入 5 ml DMEM-10% FBS，避免冲散乳腺癌细胞或骨碎片。将培养板置于 37 °C 组织培养孵育箱中孵育 20–24 小时。
6. 进行生物发光成像（BLI）时，从孵育箱中取出培养板，并向每孔加入荧光素底物（终浓度为 300 µg/ml）。立即使用 IVIS 成像系统进行成像，参数设置如下：光圈 f-stop 为 1，小 binning 模式，曝光时间为 1 秒，等级 D。以平均辐射通量（光子/秒/平方厘米/球面度）测量每孔的信号强度。
7. 使用成像软件定义感兴趣区域（ROI），以定量所有实验组和对照组孔的平均辐射通量。将平均辐射通量数值导出至 Excel 表格，用于统计分析和图表绘制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Life Technologies	10569-010	所有DMEM均需补充10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素
胎牛血清	Life Technologies	16000-044
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140-122
D-荧光素（萤火虫），钾盐 5 g (30 mg/ml)	Life Technologies	L-8220
6孔TC处理细胞培养板	Corning Incorporated	3516
Friedman-Pearson咬骨钳	Fine Science Tools	16021-14
骨蜡	Surgical Specialties Corporation	903
IVIS 50成像系统	Caliper Life Sciences/PerkinElmer
MCF-7乳腺癌细胞	ATCC	HTB-22
MDA-MB-231乳腺癌细胞	ATCC	HTB-26